[发明专利]一种Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法，步骤是(1)设计并选择合适的靶向小鼠Adgrv1基因的Guide RNA及修复模板DNA；(2)体外合成Cas9 mRNA、Guide RNA和修复模板DNA；(3)将Guide RNA、Cas9 mRNA和修复模板DNA等摩尔比共同配制成注射样品对受精卵注射；(4)对获得的F0代小鼠进行鉴定；(5)阳性F0代小鼠传代及F1代小鼠的获得与鉴定。本方法可以成功获得与人类中Y6244fsX1致病突变对应的Adgrv1基因Y6236fsX1突变小鼠模型，为研究人类中Y6244fsX1致病突变的相关因素和诊断治疗提供了基础。

技术领域

本发明属于利用基因修饰技术制作基因突变动物模型技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas9技术的Adgrv1基因Y6236fsX1突变动物模型的构建方法。

背景技术

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Shot Palindromic repeats/CRISPR-associated)系统是原核生物中一种抵抗外源基因侵入的获得性免疫系统，在细菌和古生菌中CRISPR系统整合侵入宿主的噬菌体或者质粒DNA片段到CRISPR位点，然后通过相应的CRISPR RNAs(cr RNAs)引导Cas核酸内切酶对外源DNA序列进行切割，从而抵抗病毒或者噬菌体的入侵。CRISPR/Cas系统分为3种类型(TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ)，其中TypeⅡ系统因其简单、高效以及功能多样化等优点，自2013在哺乳动物细胞中成功实现基因编辑后，现已被广泛用于多种模式生物的基因组修饰技术应用中。Ⅱ型系统可以通过crRNA的引导利用单个Cas9核酸酶对DNA靶位点进行精确充分地切割。CRISPR/Cas9系统相关载体构建简单快速，便于操作，实验周期较短，且广泛适用于多个物种。在基因编辑的过程中，CRISPR/Cas9系统需要一段特殊的引导RNA，即sgRNA(single guide RNA)，sgRNA的序列选择限制性较小，只需要基因组序列中出现PAM(NGG)区即可。在sgRNA的引导下，Cas9蛋白可以对基因组实现定点切割，引起DNA双链断裂，继而引发细胞的自主修复，修复的过程可以是随机的片段缺失或插入，也可以利用特定的模板修复，从而实现对基因组的永久性修饰。

Usher综合征(Usher syndrome,USH)是一种能够引起视觉和听觉双重感官障碍的遗传性疾病，在目前已知的超过50种的视力下降合并听力受损的综合征中，以Usher综合征最为常见，该病的全球发病率为1/6000～1/10000。USH为常染色体隐性遗传病，其特征表现为视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)和感音神经性耳聋(sensorineuralhearing loss,SNHL)。USH在临床上分为3种类型，都存在因视网膜色素变性而引起的进行性视力下降，区别在于听力和前庭功能的变现各不相同。其中USH1型最为严重，临床表现有先天性耳聋、严重的听力损失，并因听力障碍导致的语言发育迟缓；此类患者还经常伴有前庭功能障碍，患儿学会独立行走的时间较同龄儿童晚。USH2型患者听力损失较轻，为中到重度耳聋，但前庭功能正常。USH3型以渐进性听力损失为特点，伴随不同程度的前庭功能失调。此外，部分Usher综合征患者还可能伴有智力衰退，嗅觉丧失，癫痫等神经系统病变。