[发明专利]一种包含共刺激受体的嵌合抗原受体及应用

权利要求书

1.一种包含共刺激受体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的结构为scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)；

其中，所述scFv(X)-(Y)CD3zeta为scFv-antihCD20-20BBZ，其序列如SEQ ID No.1所示；

Z为共刺激受体，所述共刺激受体选自OX40、HVEM、ICOS、CD27、4-1BB中的一种；

所述OX40的序列如SEQ ID No.2所示；所述HVEM的序列如SEQ ID No.3所示；所述ICOS的序列如SEQ ID No.4所示；所述CD27的序列如SEQ ID No.5所示；所述4-1BB的序列如SEQID No.6所示；所述2A的序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示。

2.一种由如权利要求1所述的嵌合抗原受体的重组表达载体构建的CAR-T细胞

3.根据权利要求2所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、慢病毒载体的构建及病毒生产；

将scFv(X)-(Y)CD3zeta，Z的中间加入2A形成融合蛋白，两端加入慢病毒载体，并和慢病毒包装质粒共同转染，获得scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)病毒；

步骤二、scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)CAR-T细胞的制备；

分离纯化后的人PBMC经过培养后，感染步骤一获得的scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)病毒，在合适的条件下进行细胞扩增，制备scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)CAR-T细胞。

4.根据权利要求3所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述慢病毒载体的构建及病毒生产的具体步骤包括：

将scFv(X)-(Y)CD3zeta，Z通过overlap PCR在其中间加入2A形成融合蛋白，两端加入酶切位点克隆慢病毒载体；将测序正确的克隆无内毒素大提，和慢病毒包装质粒共同转染，预定时间收取上清，过滤、离心浓缩病毒，获得scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)病毒。

5.根据权利要求3所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)CAR-T细胞的制备的具体步骤包括：将人PBMC经过分离纯化后，接种到具有合适刺激条件的培养板，培养预定时间后，感染步骤一生产的scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)病毒，按照合适的刺激条件进行细胞扩增，经过2轮刺激扩增后，获得的细胞即为scFv(X)-(Y)CD3zeta-2A-(Z)CAR-T细胞。

6.一种含有如权利要求2所述的CAR-T细胞的制剂。

7.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，如权利要求2所述的CAR-T细胞在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。