[发明专利]VEGF装载微球及利用其制备可注射复合微球水凝胶溶液的方法

权利要求书

1.利用血管内皮生长因子装载微球制备可注射复合微球水凝胶溶液的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A. 制备星型PLGA-mPEG嵌段共聚物：将丁二酸酐溶于无水1,4-二氧六环中，加入4-二甲氨基吡啶及三乙胺搅拌，再加入季戊四醇反应；反应后加入线性PLGA-mPEG嵌段共聚物并通入氮气保护，分别加入N,N’-二环己基碳二亚胺与4-二甲氨基吡啶继续反应，反应结束后，加入二氯甲烷溶解，再加入二氯甲烷10倍体积量以上的冰乙醚沉淀即得星型PLGA-mPEG嵌段共聚物；

B. 制备可注射复合微球水凝胶：将制备好的星形PLGA-mPEG嵌段共聚物在20℃下溶解在模拟体液(SBF)中得星形PLGA-mPEG嵌段共聚物溶液，加入VEGF装载微球和血管内皮细胞混合，即得可注射复合微球水凝胶溶液；

所述装载微球由以下步骤制得：

1）线性PLGA-mPEG嵌段共聚物制备：在反应器中加入单甲醚聚乙二醇，加热使之熔融后加入丙交酯和乙交酯，在干燥氮气的保护下加热使其完全熔融，加入辛酸亚锡，升温至150～180℃，反应6～10h后，加入二氯甲烷和冰乙醚提纯得到线性PLGA-mPEG嵌段共聚物；

2）微球制备：将线性PLGA-mPEG嵌段共聚物溶解于二氯甲烷中得A液，将VEGF和BSA溶解在去离子水中得B液，将A液、B液混合在冰浴条件下均质乳化，之后室温条件下加入聚乙烯醇水溶液混合、分离得沉淀，沉淀经洗涤、冷冻干燥即得血管内皮生长因子装载微球。

2.如权利要求1所述的利用血管内皮生长因子装载微球制备可注射复合微球水凝胶溶液的方法，其特征在于，步骤1）中，单甲醚聚乙二醇的用量为0.008mol，辛酸亚锡的用量为0.02g，所述丙交酯、乙交酯和单甲醚聚乙二醇的摩尔比为（1～9）：1：1。

3.如权利要求1所述的利用血管内皮生长因子装载微球制备可注射复合微球水凝胶溶液的方法，其特征在于，步骤2）中，A液中，线性PLGA-mPEG嵌段共聚物的含量为50mg/ml；B液中，VEGF和BSA的含量为30 mg/ml，VEGF和BSA的质量比为1:1；A液、B液、聚乙烯醇水溶液的体积比为（2～4）:（0.5～0.7）：（260～370）。

4.如权利要求1所述的利用血管内皮生长因子装载微球制备可注射复合微球水凝胶溶液的方法，其特征在于，步骤2）中，聚乙烯醇水溶液的质量浓度为4%，聚乙烯醇水溶液分两次加入，两次加入聚乙烯醇水溶液的体积比为（1～2）：（25～35），第一次加入聚乙烯醇水溶液后搅拌3～6min，形成微球，第二次加入聚乙烯醇水溶液后搅拌3～5h。

5.如权利要求1-4任一所述的利用血管内皮生长因子装载微球制备可注射复合微球水凝胶溶液的方法，其特征在于，步骤A中，丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、季戊四醇四者的摩尔比为1:1:1:0.25，丁二酸酐与无水1,4-二氧六环的用量比为0.01mol：300mL，线性聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物与季戊四醇的摩尔比为4:1，N,N’-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶与丁二酸酐的用量比为0.005mol：0.005mol：0.01mol。

6.如权利要求5所述的利用血管内皮生长因子装载微球制备可注射复合微球水凝胶溶液的方法，其特征在于，步骤B中，星形嵌段共聚物溶液中星形嵌段共聚物的质量浓度为40%；VEGF装载微球与星形嵌段共聚物溶液的质量比为（1～8）：100，血管内皮细胞加入时以细胞培养液的形式加入，细胞培养液与的星形嵌段共聚物溶液的体积用量比为：1:5～1:20；细胞培养液中血管内皮细胞的含量为5×10⁴～5×10⁵个/mL。