[发明专利]一种衍生化的含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离分析方法

说明书

本发明公开了一种衍生化的含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离分析方法，该二糖质量和质谱检测峰面积的函数关系可用于实际生物样品中肝素和硫酸类肝素二糖的定量检测。本发明能在液相‑质谱分析中检测肝素和硫酸类肝素二糖，尤其是含有游离氨基的硫酸类肝素二糖，也可利用常规液相色谱分离并结合紫外和荧光检测器来进行分析。这对研究临床药物肝素、硫酸类肝素、肝素衍生物和各种生物样品的二糖组分有重要的作用。

技术领域

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种衍生化的含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离分析方法。

背景技术

肝素和硫酸类肝素是线性糖胺聚糖，由于肝素具有较强的抗凝作用，被广泛运用于治疗血栓栓塞性疾病、心肌梗死等疾病。肝素中不同的硫酸化、乙酰化和游离氨基取代模式形成了不同的二糖单元，赋予了肝素和硫酸类肝素众多的生物功能，参与了血管形成、血液凝固、细胞粘附及增生和肿瘤转移等生命活动。肝素和硫酸类肝素由重复的二糖单元组成，二糖单元由己糖醛酸和葡萄糖胺以1-4糖苷键连接而成，其中十二种代表性的二糖单元中存在常规的N-硫酸化葡萄糖胺、N-乙酰化葡萄糖胺和稀有的含游离氨基的葡萄糖胺残基。

最近有研究发现，含游离氨基的硫酸类肝素在乳腺癌细胞中的浓度相当高，可抑制乙酰肝素酶的活性。利用人工化学合成含游离氨基的葡萄糖胺残基的四糖进行体外实验，发现它通过竞争性抑制乙酰肝素酶的活性从而进一步抑制了乳腺癌细胞的转移[S.Nadanaka, et al. J. Biol. Chem., 2014，289:15231-43]。此外有报道指出，含游离氨基的硫酸类肝素通过抑制肿瘤组织中血管生成和血管内皮生长因子的表达和血管生成，从而抑制肿瘤的转移[陈金联等. 世界华人消化杂志, 2005, 13(22):2685-2688]。含游离氨基的硫酸类肝素有希望成为抗肿瘤活性抑制剂。因此无论是天然的硫酸类肝素/肝素或人工合成的衍生物，构建含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离和分析方法具有极大的挑战，也是更好地理解含游离氨基的硫酸类肝素的生物功能的基础。

分析肝素和硫酸类肝素的组分含量时，通常使用肝素酶酶解产生12种主要的肝素/硫酸类肝素二糖，再对二糖进行分析测定。传统的分析肝素/硫酸类肝素二糖的技术包括高效液相色谱[Wei Z, et al. J. Biol. Chem., 2005, 280(16):15742]、毛细管电泳法[Hitchcock A M, et al. Electrophoresis, 2008, 29(23):4538-4548]、凝胶色谱法[Chuang W L, et al. J Chromatogr A, 2001, 932(1):65-74]、排阻液相色谱-质谱联用技术、亲水液相色谱-质谱联用技术[Gill V L, et al. Anal. Chem., 2013, 85:1138-1145]等。这些分析技术主要用于分析8种常规肝素/硫酸类肝素二糖。进一步地，专利CN104914205B公开了一种一种含N -非取代葡萄糖胺（GlcNH₃⁺）硫酸类肝素二糖的分离分析方法，该质谱峰面积校正因子可用于实际生物样品中硫酸类肝素和肝素二糖的定量检测，但是该方法采用胺类离子对试剂进行分析。目前普遍认为离子对试剂存在污染质谱的离子源的风险，会导致质谱灵敏度的下降[Yang B, et al. Anal. Biochem., 2011, 415(1):59-66]。

因此，建立分析肝素/硫酸类肝素二糖的新方法，减少分析过程中对质谱的损伤具有重要的意义。而2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC)是荧光疏水性分子，能与肝素/硫酸类肝素二糖发生还原胺化反应从而连接到二糖上。同时，荧光疏水性分子标记技术能促进肝素/硫酸类肝素二糖的分离。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种衍生化的含游离氨基的硫酸类肝素二糖的分离分析方法，本发明能在液相-质谱分析中检测硫酸类肝素二糖，尤其是含游离氨基的硫酸类肝素二糖，也可利用常规液相色谱分离并结合紫外和荧光检测器来进行分析。这对研究临床药物肝素、硫酸类肝素、肝素衍生物和各类生物样品的二糖组分具有重要的作用。