[发明专利]一种特异性检测百合隐症病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

一种特异性检测百合隐症病毒LSV的IC‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法，试剂盒主要包括特异性LSV抗体IgG、特异性RT反向引物LSV‑R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；特异性LAMP引物组由正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，正向环引物LF和反向环引物LB组成；阴性对照品为ddH2O，阳性对照品为兰州百合LSV CP基因标准品；本发明不用提取RNA，不需要酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等分子生物学专业仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，特异性和灵敏度高，操作简便，适用性强，可用于监控百合LSV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

技术领域

本发明涉及一种特异性检测百合隐症病毒LSV的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。

背景技术

百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质，其中百合隐症病毒(Lily symptomless virus，LSV)是发生最普遍的病毒之一，以兰州食用百合为例，最新的病毒病田间调查结果显示，LSV感染率高达98.2%（Zhang et al., 2018），病毒病造成百合种源严重退化，已成为制约百合产业发展的重要因素。

LSV属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，是正义单链 RNA 病毒；LSV基因组为不分段 RNA，全长为 8394 bp，5′端含帽子结构，3′端有polyA 尾巴，共有 6 个开放阅读框(ORF)，编码 4 个蛋白，依 5′至 3′分别编码：RNA 依赖的 RNA 聚合酶(RdRp)，三基因连锁结构(TGBp1-3)，外壳蛋白(CP)和核酸结合蛋白；LSV的ORF1为RdRp，编码一个蛋白(220kD)，与病毒在植物体内复制有关；ORF2、ORF3 和 ORF4 分别编码 TGBp1、TGBp2 和 TGBp3(25 kD，12 kD，7 kD)，是病毒在宿主体内运动的 3 个基因序列互相重叠的运动蛋白(MP)；ORF5为CP，编码唯一参与病毒颗粒形态构成的蛋白质(32kD)；ORF6推测是核酸结合蛋白(16kD)，该蛋白含有一个CysZ-CysZ结构的锌指结构域。

防治百合病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此LSV的检测对于百合病毒病的防治具有重要的意义。

目前，针对LSV的常用检测技术主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫捕获(IC)-RT-PCR和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法等。ELISA方法易污染，且交叉反应比较严重，假阳性多，灵敏性偏低；RT-PCR和Real-time PCR方法检测灵敏度高，但是上述方法操作复杂，对检测人员的技术要求高，还必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留的多酚和多糖会严重影响检测的灵敏度和特异性；IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR两种方法的优点，不用提取RNA，但其灵敏度仍有待提高；除此之外，上述方法都必须依赖酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备才能完成检测。

DNA环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成茎环结构和多环花椰菜样结构DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。