[发明专利]一种特异性检测百合斑驳病毒的试剂盒及其检测方法

说明书

一种特异性检测百合斑驳病毒LMoV的IC‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法，试剂盒主要包括特异性LMoV抗体IgG、特异性RT反向引物LMoV‑R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；特异性LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；阴性对照品为ddH2O，阳性对照品为兰州百合LMoV CP基因标准品；本发明不用提取RNA，不需要酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等分子生物学专业仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，特异性和灵敏度高，操作简便，适用性强，可用于监控百合LMoV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

技术领域

本发明涉及一种特异性检测百合斑驳病毒LMoV的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。

背景技术

百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质，其中百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)是发生最普遍的病毒之一，其在世界范围内广泛分布，特别是在适合其寄主生长的所有温带地区及蚜虫媒介丰富的地区尤为普遍。最新的病毒病田间调查结果显示，LMoV也是兰州食用百合的主要病毒（Zhang et al., 2018）。病毒病造成百合种源严重退化，已成为限制我国百合生产和切花出口的重要原因之一。

LMoV侵染百合科植物常造成叶片有斑驳条纹甚至坏死斑，后期发展为花、叶片卷曲畸形，开碎色花，并常伴随植株矮小、花与球茎的减产等。LMoV属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属（Potyvirus），病毒粒子为弯曲线状且呈螺旋对称，大小（650～900）nm ×（11～15）nm。病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，具有potyvirus属成员的典型基因组结构特征，包括一个Poly（A）尾巴，编码一个由3095个氨基酸组成的分子量为351.0 kDa的多聚蛋白。多聚蛋白通过自我剪切后形成外壳蛋白（CP）等10个不同大小的功能蛋白。LMoV CP亚基由274 aa组成，大小为30kDa左右，组装成外壳包裹病毒RNA。

防治百合病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此LMoV的检测对于百合病毒病的防治具有重要的意义。

目前，针对LMoV的常用检测技术主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫捕获(IC)-RT-PCR和实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法等。ELISA方法易污染，且交叉反应比较严重，假阳性多，灵敏性偏低；RT-PCR和Real-time PCR方法检测灵敏度高，但是上述方法操作复杂，对检测人员的技术要求高，还必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留的多酚和多糖会严重影响检测的灵敏度和特异性；IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR两种方法的优点，不用提取RNA，但其灵敏度仍有待提高；除此之外，上述方法都必须依赖酶标仪、PCR仪或荧光定量PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备才能完成检测。

DNA环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异性区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA酶在恒温条件下快速、高特异性地扩增靶基因，扩增产物是一系列反复重复的靶序列构成茎环结构和多环花椰菜样结构DNA片段的混合物，在电泳凝胶中呈阶梯状的特殊条带。在LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过肉眼观察判定结果。

与常规检测的PCR方法相比，LAMP技术在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优势，在食品安全监测、动植物病原物和医学病原物检测中被广泛应用。