[发明专利]一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种特异性检测百合黄瓜花叶病毒CMV的IC-RT-LAMP试剂盒，包括特异性CMV抗体IgG、特异性RT反向引物CMV-R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂，所述特异性LAMP引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB，所述特异性RT反向引物CMV-R以及LAMP引物组的序列如下：

CMV-R：5’- CACTCCGGACGTGGGAATAC -3’

F3：5’-GCCTCACCGGTACTGGTT-3’

B3：5’- GACGTGGGAATACGTTGGT -3’

FIP：5’- CCTATATCAGCGCGCATCGCCATCAGTACGCTGCATCTGGA -3’

BIP：5’-TGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGCTCGACGTCAACATGAAGT-3’

LF：5’- CAACAGTTTGTTGTTAGCTTGGAC -3’

LB：5’- GTATTCAAAAGACGATGCACTCGA -3’

其特征在于：所述试剂盒还包括CMV抗体IgG 包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBR Green I荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品，所述阴性对照品为ddH₂O；所述阳性对照品为兰州百合CMV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：

兰州百合CMV CP基因标准品：

TTCCTGCCTCCTCGGACTTATCCGTTGCCGCCATCTCTGCTATGTTTGCGAACGGAGCCTCACCGGTACTGGTTTATCAGTACGCTGCATCTGGAGTCCAAGCTAACAACAAACTGTTGTATGATCTTTCGGCGATGCGCGCTGATATAGGCGACATGAGAAAGTACGCCGTCCTCGTGTATTCAAAAGACGATGCACTCGAGACAGACGAGTTAGTACTTCATGTTGACGTCGAGCACCAACGTATTCCCACGTCCGGAGTG。

2.一种采用如权利要求1所述的特异性检测百合黄瓜花叶病毒的IC-RT-LAMP试剂盒特异性检测百合黄瓜花叶病毒的检测方法，其特征在于：

①抗体制备：纯化CMV天然病毒粒子，用其免疫动物，获得特异性的CMV抗体IgG；

②免疫捕获IC：将步骤①获得的特异性的CMV抗体IgG包被在反应容器中，特异捕获待测样品中的CMV粒子；

③反转录RT：以步骤②捕获的CMV粒子为模板，利用CMV的特异性RT反向引物CMV-R和第一链cDNA合成试剂进行反转录RT反应，以此获得第一链cDNA；

④LAMP扩增：以步骤③得到的第一链cDNA作为模板，用LAMP特异性引物组和LAMP扩增反应试剂进行LAMP扩增，并以ddH₂O作为阴性对照，以兰州百合CMV CP基因标准品作为阳性对照；

⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得LAMP扩增结果判断待测样品中是否含有百合CMV。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤①所述CMV抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品中是否含有百合CMV的具体方法为荧光染料肉眼观察法；所述荧光染料肉眼观察法为：取SYBR Green I 荧光染料反应液加入步骤④所述LAMP扩增的反应产物中，采用肉眼直接观察，若扩增产物出现绿色，说明SYBR Green I染料与双链DNA 结合，则为阳性反应，表示样品中含有百合CMV；若扩增产物颜色为橙色则为阴性反应，表示样品中不含百合CMV。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤⑤中根据扩增结果判断待测样品中是否含有百合CMV的具体方法为琼脂糖凝胶电泳检测技术；所述琼脂糖凝胶电泳检测技术为：将步骤④所述LAMP扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增产物呈明亮的弥散状核酸泳带，则为阳性反应，表示样品中含有百合CMV；若扩增产物无核酸泳带，则为阴性反应，表示样品中不含百合CMV。