[发明专利]检测百合南芥菜花叶病毒的试剂盒及检测方法

说明书

一种特异性检测百合南芥菜花叶病毒ArMV的IC‑RT‑LAMP试剂盒及其检测方法，试剂盒主要包括特异性ArMV抗体IgG、特异性RT反向引物ArMV‑R、特异性LAMP引物组、第一链cDNA合成试剂、LAMP扩增反应试剂、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；特异性LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和正向环引物LF组成；阴性对照品为ddH2O，阳性对照品为切花百合ArMV CP基因标准品；本发明不用提取RNA，不需要酶标仪和PCR仪等分子生物学专业仪器设备，在恒温水浴中即能完成扩增反应，特异性和灵敏度高，操作简便，适用性强，可用于监控百合ArMV病毒的发生、扩散和流行，适合在基层推广应用。

技术领域

本发明涉及一种特异性检测侵染百合的南芥菜花叶病毒ArMV的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法。

背景技术

百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质，病毒病造成百合种源严重退化，已成为限制我国百合生产和切花出口的重要原因。目前文献报道侵染百合的病毒有20多种，除百合斑驳病毒（Lily mottle virus, LMoV），黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)和百合隐症病毒(Lily symptomless virus, LSV)外，南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus, ArMV）也是其中一种（Kulshrestha et al., 2005）。2017年，在田间病毒调查中，我们首次在甘肃地区种植的切花百合索邦品种中检测到ArMV病毒。ArMV侵染百合的症状主要表现为叶片斑驳、花叶、黄化褪绿，矮化甚至坏死等症状（Zheng et al., 2013）。

ArMV属于豇豆花叶病毒科（Comoviridae）线虫传多面体病毒属(Nepovirus)成员，是我国进境植物检疫性有害生物，该病毒主要通过汁液摩擦接种，种苗传播,也可通过介体线虫传播。ArMV寄主范围广泛，可感染215个植物种，国外学者曾在葡萄树NW分离物上确定了ArMV基因组RNA1和RNA2的核苷酸序列（Kulshrestha et al., 2005）。其中，RNA2去除聚合A末端全长3820bp，编码一个包含1110个氨基酸多肽的开放阅读框(ORF)(nt296-3626)，开放阅读框5’端为一个295nt的非编码区域，3’端为一个192nt的非编码区域，编码2A，2B^MP运动蛋白和2C^CP外壳蛋白基因。

防治百合病毒病主要依靠准确的病毒检测、无毒种苗繁殖、病株移除以及检验检疫等。这些防治措施的前提是灵敏、准确、快速的病毒检测，因此ArMV的检测对于百合病毒病的防治具有重要的意义。

目前，针对ArMV的常用检测技术主要有酶联免疫吸附法（ELISA）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、免疫捕获(IC)-RT-PCR等。ELISA方法易污染，且交叉反应比较严重，假阳性多，灵敏性偏低；RT-PCR方法检测灵敏度高，但是上述方法操作复杂，对检测人员的技术要求高，还必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留的多酚和多糖会严重影响检测的灵敏度和特异性；IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR两种方法的优点，不用提取RNA，但其灵敏度仍有待提高；除此之外，上述方法都必须依赖酶标仪和PCR仪等昂贵的分子生物学专业仪器设备才能完成检测。