[发明专利]一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系及检测方法

权利要求书

1.一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)PPV和PCV2病毒DNA的提取；

2)CSFV、PRRSV和JEV病毒RNA的提取以及反转录；

3)特异性引物设计与筛选；

4)对步骤3)所设计的特异性引物进行PCR反应条件优化，从而建立最佳多重PCR反应体系；

5)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR扩增特异性验证；

6)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR敏感性验证；

7)按照步骤4)建立的最佳多重PCR反应体系进行多重PCR稳定性验证；

8)按照建立的多重PCR方法对临床样品的检测，以验证该方法的可行性。

2.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，步骤1)所述的PPV和PCV2病毒DNA的提取方法为：取适量PPV和PCV2病毒液，置于1.5mL Eppendorf管中，参照上海生物工程的DNA提取试剂盒说明书进行，将提取的基因组DNA置于-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，CSFV、PRRSV、JEV病毒RNA的提取及反转录方法为：取CSFV、PRRSV和JEV病毒液，参照Magen公司Hipure Viral RNA Spin Kit试剂盒说明书提取病毒RNA，将提取的病毒RNA反转录成cDNA，按照Magen公司M-MLV H-First-StandSynthesis Kit反转录试剂盒说明书进行，将反转录的cDNA置于-20℃保存备用。

4.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，步骤3)中所述特异性引物的设计与筛选具体为：应用生物学软件对CSFV、PPV、PRRSV、JEV和PCV2基因进行同源性分析，筛选确定引物，确保所设计引物必须为特异性引物，一对引物只能扩增出相应病毒的序列片段，并且与其它引物之间没有干扰，即没有同源、互补，不形成发卡结构；所述设计的引物序列为：

CSFV的特异性引物：

F:5′-TGCAACTGAATGACGGGAC-3′

R:5′-GCCAAATACCTCCTACTGACCAC-3′

PPV的特异性引物：

F:5′-AAAAACAATCCACCAGGACAAC-3′

R:5′-CTGGATCTCATTTTTGCTGTGA-3′

PRRSV的特异性引物：

F:5′-CGGGCGGTATGTCCTAAGTA-3′

R:5′-ACCTCAACTTTGCCCCTTTT-3′

JEV的特异性引物：

F:5′-AGCTTGTTGGACGGCAGAG-3′

R:5′-GCCACATGATTGAGCCTTCA-3′

PCV2的特异性引物：

F:5′-CTATCAAGCGAACCACAGT-3′

R:5′-GGTCTACATTTCCAGCAGT-3′。

5.根据权利要求1所述的一种同步检测猪五种繁殖障碍性病毒病多重PCR体系的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中所述的PCR反应条件优化具体方法为：选择25μL的PCR反应体系，体系包含10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL，2.5mmol/L dNTP 3.0μL，5U/μL Taq聚合酶0.4μL，DNA与cDNA混合模板2.0μL，上下游引物浓度为10μmol/L，ddH2O补足至25μL，根据多重PCR条带的明暗度，适当调整3对引物加入量的比例；退火温度根据引物Tm值范围进行，根据梯度PCR仪将退火温度设定为49.5℃、50.8℃、51.7℃、54.1℃、56.6℃、57.8℃、58.7℃、59.5℃、60.0℃，同时对循环次数的条件在单一变量的情况下进行优化，最终确定最佳多重PCR反应体系及反应程序，循环次数按照为20、30、35、40设置。