[发明专利]一种基于BSA的超分辨成像探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于BSA的超分辨成像探针及其制备方法和应用，该超分辨成像探针为包裹了Alexa Fluor 594染料的BSA纳米球，并且其表面偶联了HER2抗体；该探针具有荧光闪烁特性，可用于超分辨单分子定位成像；另外，该探针能靶向高表达HER2的肿瘤细胞，并能通过受体介导的内吞作用进入细胞；通过SMLM成像技术即可对摄入了该探针的肿瘤细胞进行超分辨光学成像；本发明实现了超分辨成像探针在细胞内进行超分辨成像的应用，利用SMLM显微镜，能够对探针在细胞内的分布进行精确定位。

技术领域

本发明涉及超分辨成像探针领域，特别涉及一种基于BSA的超分辨成像探针及其制备方法和应用。

背景技术

近几年出现的超分辨率显微技术具有对超出光学衍射极限的亚细胞结构的成像能力，使得我们对细胞的研究发生了革命性的变化，因为超分辨率显微镜可以通过图形化的照明，如受激发射损耗（STED），或者通过图像重建的光激活的定位显微镜（PALM）和光学重建显微镜（STORM）。同时，由于当前可用的荧光探针的不断开发，通过单分子定位的PALM/ STORM的最终空间分辨率几乎可以实现在细胞内的分子追踪。从概念上讲，PALM / STORM通过调节激活和激发激光器的状态，实现荧光团在荧光（“开”）和暗（“关”）态之间的随机切换，然后将包含所有荧光团发光位置的荧光图像结构重建形成超分辨图像。而目前已报道的适用于单分子定位成像的光学探针包括有机染料，量子点（QDs），碳点（CDs）和荧光蛋白（例如：绿色荧光蛋白，GFP）等等。通常，观察这些探针的荧光“开”和“关”（闪烁）行为须在一些严格的条件下才能实现，例如多个照明激光器，高功率激光照射或毒性成像缓冲溶液等等。这些要求使得PALM / STORM成像过程相对复杂和麻烦，更加限制了超分辨成像在活细胞成像的应用。因此，开发在温和条件下具有光学闪烁行为的新型纳米探针对于超分辨成像技术的发展将尤为重要。

受体介导的内吞（receptor mediated endocytosis)是一种特殊类型的内吞作用,主要是用于摄取特殊的生物大分子.被吞入的物质首先同细胞质膜的受体蛋白结合,同受体结合的物质称为配体(ligand)。受体介导的内吞作用有两个主要特点:①配体与受体的结合是特异的,具有选择性; ②要形成特殊包被的内吞泡。内吞过程大致分为四个基本过程∶①配体与膜受体结合形成一个小窝(pit); ② 小窝逐渐向内凹陷.然后同质膜脱离形成一个被膜小泡;③ 被膜小泡的外被很快解聚,形成无被小泡,即初级内体;④ 初级内体与溶酶体融合,吞噬的物质被溶酶体的酶水解。

利用单分子定位显微技术的超高分辨率，有望细致地观察到纳米粒子通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞后，在细胞内的分布及定位。这有利于研究纳米粒子与细胞之间的相互作用。

发明内容

本发明为了克服传统光学显微镜存在的光学衍射极限，提供了一种荧光闪烁良好、制备过程简单超分辨成像探针，可用于探究通过受体介导的内吞作用进入肿瘤细胞的纳米材料的光学超分辨定位及分布研究。本发明还提供了该超分辨成像探针的制备方法及其应用。

一种可靶向肿瘤细胞进行超分辨成像探针的制备方法，具体步骤如下：以BSA为基质合成BSA纳米球，向BSA纳米球中掺入Alexa Fluor 594染料后，加入HER2抗体溶液以及偶联剂，并在掺了染料的BSA纳米球表面偶联HER2抗体，即可得到超分辨成像探针。掺入的Alexa Fluor 594染料具有荧光闪烁特性，可用于单分子定位成像。

作为本发明的一种改进，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将BSA溶解于PBS溶液中，用碳酸氢钠调节PH，向溶液中加入Alexa Fluor 594NHS ester，并放于摇床摇晃反应，得到偶联了染料的BSA溶液；

（2）向BSA溶液中加入经过步骤（1）所得的偶联了染料的BSA溶液，得到混合的BSA溶液；向混合的BSA溶液中加入无水乙醇以及偶联剂溶液并搅拌，得到掺入了染料的BSA纳米球溶液；待反应结束后，用超滤管离心提纯即得到掺入了染料的BSA纳米球；