[发明专利]兔睾丸DNA指纹鉴定试剂盒及鉴定方法

说明书

本发明涉及中药检测技术领域，是一种兔睾丸DNA指纹鉴定试剂盒及鉴定方法。试剂盒包括：兔睾丸基因组DNA提取试剂和兔睾丸PCR鉴定试剂。鉴定方法包括：兔睾丸基因组DNA的提取、设计兔睾丸mtDNA Cyt b基因的特异性引物、建立PCR反应体系和反应程序、琼脂糖凝胶电泳检测兔睾丸DNA指纹图谱和结果判定等步骤。本发明利用兔睾丸独一无二的mtDNA Cytb基因序列，设计的特异性引物，能够准确、特异的鉴定兔睾丸与其易混品种；鉴定方法简便、快速；鉴定结果准确、可靠；鉴定试剂使鉴定方法更标准化、更规范化。

技术领域

本发明涉及使用生物技术鉴定兔睾丸与其易混品种DNA指纹鉴定试剂盒及鉴定方法。

背景技术

兔睾丸属于我国地方习用性中药材，是长春银诺克药业有限公司生产的“参雄温阳胶囊”[国药准字Z20026979，执行标准为国家药品监督管理局标准(试行)，药品标准编号WS-11257(ZD-1257)-2002]的主要成分。“参雄温阳胶囊”主治补肾壮阳，用于肾阳虚衰所致的阳痿、早泄、遗精、少精、死精等，具有增强体质，提高免疫力等功效。针对我国目前不孕不育年轻化越发严重的状况，参雄温阳胶囊的疗效日益受到重视。作为主要成分兔睾丸的真伪直接影响着参雄温阳胶囊的质量和疗效，因此急需一种能准确、快速、可靠的鉴定兔睾丸真伪的检验试剂和鉴定方法。

目前，鉴定兔睾丸常用的方法包括基源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定，但当兔睾丸经加工、炮制后，失去原来的特征，难以鉴定真伪。本发明应用兔睾丸mtDNA Cytb基因这一特异的分子遗传标记技术，具有种属特异性强、准确性高，重复性好等优点，能从分子水平解决中药宏观鉴定的局限，利于中药鉴定的标准化、规范化和国际化。

线粒体是存在于真核细胞内的具有半自主性的细胞器，是细胞进行呼吸活动、产生能量的重要场所。在线粒体内部存在着线粒体自身的遗传物质--线粒体DNA(mitochondrial DNAmtDNA)，mtDNA是一共价闭合的双链环状的遗传物质，具有分子量小、结构简单、易于分离、拷贝数高、突变率高、进化速度快、母性遗传、无组织特异性、高保守性等特点，有利于进行种内和种间的遗传变异和进化研究。mtDNA已被作为一种较为理想的分子标记应用于生物遗传多样性和进化分类等方面。

线粒体细胞色素b(Cytochrome Cytb),位于线粒体内膜磷脂双层中，是参与氧化磷酸化合成ATP过程电子传递链中的重要物质，是线粒体自身编码的为数不多的功能蛋白。Cytb基因进化速度适中，适于分析种间或属间差异，因此，在生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究中,mtDNA Cytb是一个十分有效的分子遗传学标记，得到广泛应用。本发明利用兔睾丸mtDNA Cytb基因，设计特异性引物，从分子水平上对兔睾丸及其伪品进行真伪鉴定，为兔睾丸的真伪鉴定提供标准化、规范化的检验方式。

目前国家标准中尚无兔睾丸的法定鉴别方法，国内亦无兔睾丸真伪鉴定的相关文献报告。本发明专利基于选择家兔的mtDNA Cytb基因特异位点用于兔睾丸真伪的鉴别。从家兔mtDNA Cytb基因组进行筛选，采用高通量技术分析具有鉴别序列片段作为鉴别点，建立PCR反应体系，因无需对兔睾丸原药成分进行逐一分离，方法可快速、简便，在不失原药材本性的条件下直接判断兔睾丸的真伪。

发明内容

本发明采用生物信息学技术对家兔的mtDNA基因组进行分析，利用Genbank中的相关信息，根据兔与其他相关动物的mtDNA基因组序列的差异，选取Cytb基因作为特异性靶基因，应用primer 5.0设计软件，设计兔睾丸的特异性引物。利用PCR技术，在一个反应体系中加入一对兔睾丸的特异性引物，针对兔睾丸的DNA模板序列,扩增出一段兔睾丸的特异的目的片段。从而可以准确有效的将兔睾丸及其易混品种从DNA水平上区分开来。具有简便、快捷、高效的特点。

本发明的目的是在于提供兔睾丸与其易混品种的鉴定试剂盒和鉴定方法，建立一种简便、快速、准确、特异的鉴定技术，提供一种标准化、规范化的检验方式。