[发明专利]一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法

说明书

本发明公开一种热启动TaqDNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：(1)将纯化的TaqDNA聚合酶作为底物包被，利用噬菌体展示技术进行三轮的淘选流程，得到富集的同底物具有高亲和力的阳性备选配体；(2)分析富集的阳性备选配体序列组成，同底物结构比对后，选择若干可以与之结合的阳性克隆，利用大肠杆菌体外表达系统表达得到系列阳性配体；(3)将体外表达得到的配体、TaqDNA和多克隆抗体按照3：3：1的比例混合后得到热启动TaqDNA聚合酶。本发明制备的热启动TaqDNA聚合酶，能够在最大限度保持酶活性的基础上常温更好的封闭酶的活性，在分子诊断多个平台上验证其使用效果优于传统的热启动TaqDNA聚合酶。

技术领域

本发明涉及生物学技术领域具体涉及一种热启动Taq DNA聚合酶及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应技术(PCR反应)是现代生物技术的核心技术之一，该技术的原理为利用Taq DNA聚合酶在体外利用与目的模板特异结合的上下游引物，通过95℃变性、60℃退火、72℃延伸三个步骤经过25-40个循环达到对目的基因片段的大量扩增。该技术经过近40年的发展，已经广泛的应用于生物科学科研和医学检测中。

随着检测技术的发展和需求的提高，PCR技术已经由之前的定性分析发展到了定量分析。通过实时荧光定量技术，检测人员可以实现对样品中的较低的病毒数量进行检测分析，为医生提供更为早期的诊断依据。而传统的Taq DNA聚合酶由于其在常温下具备一定的活性，从而容易造成引物二聚体和非特异扩增，进而造成检测结果的偏离甚至产生假阳性的结果。

针对这一应用需求开发出了热启动技术，其核心机制在于抑制Taq DNA聚合酶常温下的活性反应。目前常见的热启动技术分为：1石蜡包埋法；2抗体抑制法；3化学修饰法等：

1、石蜡包埋法的原理是将Taq DNA聚合酶包埋于石蜡小球中，常温下酶同反应体系隔绝，加热后石蜡融化释放酶参加反应。但石蜡球制备复杂，且石蜡对于荧光读取有一定干扰，使用受到很大限制。

2、抗体抑制法使用传统单克隆抗体，低温抗体同酶结合抑制活性，高温抗体失活释放活性。本方法为目前主流方法之一。但抗体抑制法的问题在于：a.传统的单克隆抗体制备方式无法在制备阶段特异性的针对酶的活性位点进行制备，所以对于酶的抑制效果有限，即对于扩增反应中无模板对照组(NTC)的抑制效果有限，无法满足高特异性应用的需求。b.单克隆抗体制备成本较高，且抗体批次稳定性较差也限制了其大规模的应用。

3、化学修饰法使用生化试剂对特定氨基酸进行修饰，进而达到抑制活性的作用。化学修饰法成本较抗体抑制法低，也是主流热封闭技术。但化学封闭技术容易造成Taq DNA聚合酶结构的不可逆损伤，进而影响活化后酶的灵敏度，不适用于一些对检测灵敏度高的应用。而且由于化学修饰的自身的稳定性，导致打开化学键释放酶活性的过程需要大量的能量，体现在反应中则需要95℃更长的时间。已ABI公司的金牌热启动Taq酶来说激活过程长达10-15min。大大增加了反应时间，增加了反应的不确定性。

总体来说，热启动技术的重点集中在不损失酶活性的基础上的常温活性控制。化学修饰由于其“无差别”封闭的特点会造成活性的损失，渐渐的不能适应更高的检测要求。而传统的单克隆抗体由于缺少有效的检测方法，很难筛选到正好能针对活性位点结合的抗体株。同时酶的活性是由多个活性区域决定的，单一抗体很难满足需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种由噬菌体体外展示筛选得到特异性系列配体配合多克隆抗体的热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，弥补市面上常规的抗体抑制法和化学修饰法制备出的热启动Taq DNA聚合酶存在的缺点，为分子诊断和科研提供特异性更好、扩增效率更高的热启动Taq DNA聚合酶。

为了实现上述目的，克服现有技术存在的不足，本发明采用以下技术方案：一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，具体步骤如下所述：