[发明专利]一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法

说明书

本发明涉及一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法，所述方法包括：(1)乳清蛋白水解；(2)衍生化处理；(3)固相萃取(SPE)；以及(4)反相高效液相色谱分析(HPLC)。本发明方法用以解决目前没有统一的针对乳清蛋白中赖丙氨酸含量测定方法的问题，该方法操作流程标准规范，检测精度高，其检出限可以达到0.5mg/Kg，同时精密度、准确度和重现性均较为理想。

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法。

背景技术

乳清蛋白(whey protein)是从牛奶中提取的一种蛋白质，被称为蛋白之王，具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一，在食品行业中应用广泛。

乳清蛋白在食品工业的应用中，常常会经历热处理和碱处理这两种常见的加工手段。然而，热处理乳清蛋白，尤其是在碱性条件下，能够促使交联氨基酸的产生，其中包括赖丙氨酸(Lysinoalanine，LAL)。赖丙氨酸，即N(6)-(DL-2-氨基-2-羧乙基)-DL-赖氨酸，其化学结构式如式1所示。LAL有2个光学活性中心，因此它有LL-、LD-型和DL-、DD-型两对旋光异构体，由于形成DD-与DL-型的条件苛刻、时间较长，所以LL-和LD-型比较常见。LAL的形成会导致食物中的营养素(如赖氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和其他磷酸蛋白)被破坏。与此同时，LAL还会损坏并降低消化酶的活性，影响人体对蛋白质的消化和利用，此外，LAL也被证实能够引发大鼠肾脏细胞损伤。因此，LAL的安全性应该被给予重视，尤其是在婴幼儿食品中，应该最大程度减少LAL的含量。

式1LAL化学结构式

目前国家没有统一的针对乳清蛋白中赖丙氨酸(以下简称LAL)的测定方法。因此，获得乳清蛋白中赖丙氨酸含量的可靠测定方法及相应测定标准的制订是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法，用以解决目前没有统一的针对乳清蛋白中赖丙氨酸含量测定方法的问题。本发明测定方法操作流程标准规范，检测精度高，其检出限可以达到0.5mg/Kg，同时对于相应国家统一测定标准的制订具有借鉴意义。

为实现上述目的，本发明的技术方案为一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法，所述方法包括下列步骤：

(1)乳清蛋白水解；

(2)衍生化处理；

(3)固相萃取(SPE)；以及

(4)反相高效液相色谱分析(HPLC)。

进一步的，各步骤具体包括下列操作：

(1)乳清蛋白水解

取蛋白含量约10mg的乳清蛋白样品放置于氨基酸水解管底部，然后缓慢注入30～50mL浓度为6mol/L的HCl溶液，使样品完全浸入HCl溶液中；向水解管中注入氮气以密封水解管，于110℃下水解氨基酸23～30小时，获得氨基酸水解液。

(2)衍生化处理

氨基酸水解液冷却至室温后，40～60℃温度下蒸发干燥，将蒸发所得残渣溶解于1mL浓度为0.4mol/L的硼酸盐缓冲液中，然后吸取250μL于5mL离心管中，依次加入500μL超纯水，250μL浓度为0.4mol/L的硼酸盐缓冲液，1mL的FMOC-Cl衍生剂；待所有上述部分混合均匀后，在室温下静置60～120min，获得样品衍生液。

(3)固相萃取(SPE)