[发明专利]淋巴因子激活杀伤细胞LAK的激活方法

说明书

本发明公开了淋巴因子激活杀伤细胞LAK的激活方法，将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(10％FCS‑RPMI 1640)调制至2×10⁶/mL，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为40‑60μg/mL的酶解多肽A、酶解多肽C或酶解多肽D以及500IU/mL的rIL‑2，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h。本发明快速激活方法在不大量使用rIL‑2的前提下，通过在培养基中添加酶解多肽A、酶解多肽C或酶解多肽D，仅使用24h即实现LAK细胞快速激活。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种淋巴因子激活杀伤细胞LAK的激活方法。

背景技术

免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。2010年，美国FDA批准世界上第一个细胞免疫治疗产品Provenge上市，充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。

淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)是在20世纪80年代由Rosenberg等研发的，其实质是IL-2激活的具有杀瘤活性的NK和T细胞。1984年11月Rosenberg研究组经美国FDA批准，首次将LAK细胞用于临床治疗。该疗法对转移性肾细胞癌、黑色素瘤、结肠癌和非霍奇金淋巴瘤患者的疗效较显著。但LAK杀伤力不强，临床应用需要大量输注。而且其扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用IL-2，从而导致明显的毒副作用，最常见和最严重的毒副作用是毛细血管渗漏综合征，主要表现为全身性水肿和多器官功能失调，可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。

目前，LAK细胞要经过体外培养至少3～7天，流程长，费用昂贵，易污染，使临床应用受到限制，故致力于简便快捷诱导培养的研究从未停止过。

发明内容

本发明旨在克服现有技术不足，提供一种淋巴因子激活杀伤细胞LAK的快速激活方法。

本发明技术方案如下：

一种淋巴因子激活杀伤细胞LAK的快速激活方法，在培养基中添加rIL-2，在培养基中还添加激活剂酶解多肽A。

优选地，所述的快速激活方法具体步骤为：

将脐血单个核细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(10％FCS-RPMI 1640)调制至2×106/mL，根据细胞总数接种于不同容量的培养容器中，同时加入终浓度为40-60μg/mL的酶解多肽A以及500IU/mL的rIL-2，置于37℃、5％CO2条件下培养24h；

酶解多肽A的制备方法为：

将脱脂的小麦胚芽粉经木瓜蛋白酶+中性蛋白酶酶解，酶解结束后灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液，冷却后，离心，上清冷冻干燥得冻干粉。

将冻干粉用超纯水溶解，然后依次用截留分子量为10000u、7000u的超滤膜对所得到的酶解液冻干粉进行分离，将超滤所得10000u～7000u组分冷冻干燥得到酶解多肽A。

优选地，酶解条件为：经木瓜蛋白酶(酶活力为80万U/g)+中性蛋白酶(酶活力为20万U/g)在复合配比3:1、pH为6.0、温度55℃、底物质量浓度40g/L、加酶量5％(100g底物加5g酶)、酶解时间8h的条件下酶解。

优选地，酶解结束后升温至90℃保持20min进行灭酶处理得到小麦胚芽的酶解液。

优选地，离心条件为：9000rpm离心25min。

优选地，采用聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法从脐血中分离脐血单个核细胞。