[发明专利]重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法

说明书

本发明公开了重组鱼类白细胞介素‑2的工程菌及其产物的制备方法，该工程菌的制备方法为：将鱼淋巴细胞的分离，丝裂原诱导，提取总mRNAs，再将总mRNAs逆转录成cDNA模版，PCR扩增得白细胞介素‑2基因片段；将IL2序列和pYES2质粒双酶切，回收相应的酶切片段后连接IL2基因和载体，连接液转化宿主菌，筛选，获得重组的IL2‑pYES2质粒；将质粒电转化导入酵母菌株中，获得酵母工程菌。有益效果为：本发明工程菌能成功、高效表达出鱼干扰素重组蛋白，工程菌产物‑重组鱼类白细胞介素‑2的产量高，重组白细胞介素‑2基因易于诱导表达且表达稳定性，不需要进行纯化即可应用。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法。

背景技术

随着我国渔业生产的迅猛发展，养殖水产动物病害日益突出，病害发生已严重制约水产业健康可持续发展，鱼类抗病毒能为差的问题显现出来，尤其是人工饲养的试验用鱼类其抵抗力较野生型的更低，因此，鱼类免疫学逐渐受到学者和养殖户们的广泛关注。在养殖中发现的多发病如草鱼病毒病（草鱼出血病）、虹蹲病毒病（传染性膜腺坏死病、病毒性出血败血症和传染性造血组织坏死病）、鲤鱼病毒病（鲤春病毒血症、鲤痘疮病和鲤鳃坏死病等）、鳗鲡病毒病（鳗鲡花丛病病毒、鳗鲡弹状病毒和类疮疹病毒等）都是由病毒引起。水环境中存在大量细菌和病毒，与其他脊椎动物相比鱼类更依赖天然免疫防御的保护。此外，长期来，由于缺乏有效的病害防治方法，各种抗生素、杀虫剂广泛使用，造成养殖环境和水产品严重污染，水产食品安全受到严重威胁，同时抗生素产生的耐药性又加剧了水产动物病害的发生。因此，研制开发天然、安全、高效的水产动物病害防治制剂及其相关应用技术是一项十分紧迫的任务。水产养殖品种重要免疫抗病基因的开发利用是从根本上解决水产动物病害防治、保障水产食品安全的最有效途径之一，代表了当前发展绿色和环境友好型水产养殖模式的主要方向。

白细胞介素（Interleukin，IL）是一类由淋巴细胞、单核细胞等产生的重要细胞因子，在调节细胞生长与分化、维持机体免疫功能、参与造血和炎症反应等过程中发挥着极其重要的作用。在白细胞介素中，白细胞介素-2是免疫细胞因子家族中最重要的成员，具有激活T、B淋巴细胞增殖分化，促进巨噬细胞吞噬杀菌以及天然杀伤细胞（NK）和细胞毒效应细胞（TCL）功能，同时还能调节多种免疫因子如干扰素、其它白细胞介素等的表达，具有全面提高机体免疫水平的功能。因此，鱼白细胞介素-2在增强鱼类的免疫功能、抗肿瘤功能和增强造血功能上有重要的应用，将其作为水产动物饲料的添加剂将极大地提高水产动物的产量和质量，同时消除了药物残留，具有天然高效的优点。但是，由于从血液中提取鱼白细胞介素-2的工艺复杂，产量低造成成本较高，难以大规模应用。鉴于国内外大量运用酵母作为真核表达系统来生产鱼白细胞介素-2，而酵母本身是优质的饲料蛋白源，因此通过酵母表达鱼白细胞介素-2并制备成含鱼白细胞介素-2的菌粉饲料添加剂是理想的选择。它可以大幅度降低生产成本，而且操作简便，具有实际应用性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组鱼类白细胞介素-2的工程菌及其产物的制备方法，工程菌能成功、高效表达出鱼白细胞介素-2重组蛋白，工程菌产物-重组鱼类白细胞介素-2的产量高，重组鱼类白细胞介素-2基因易于诱导表达且表达稳定性，不需要进行纯化即可应用。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

酵母菌种购于上海北诺生物科技有限公司。

重组鱼类白细胞介素-2的工程菌，该工程菌是具有重组鱼类白细胞介素-2基因的酵母菌。该工程菌含有重组鱼类白细胞介素-2基因的重组质粒，成功表达出鱼白细胞介素-2重组蛋白，表达量达到酵母菌细胞总蛋白的20％以上，同时该工程菌是一种稳定的微生物，生存能力较强，本身不具备致病性，不产生有毒物质，广泛使用无潜在危险性，此外该工程菌遗传性状非常稳定，经实验室内连续传代10次，经PCR检测目的基因仍遗传稳定，经SDS检测外源基因仍能稳定表达。