[发明专利]重组微生物源天然虾青素基因工程菌及其产物的制备方法

说明书

本发明公开了重组微生物源天然虾青素基因工程菌及其产物的制备方法，该工程菌的制备方法包括基因扩增、制备克隆质粒、制备重组表达质粒、制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌。工程菌产物的制备方法为：将活化后工程菌进行一级种、二级种摇瓶培养、酵罐培养，培养结束后收集菌体，避光下加入STET缓冲液和溶菌酶，搅拌均匀后置于水浴中，细胞裂解液裂解，离心上清加入异丙醇沉降，用无菌水溶解离心沉淀，冷冻干燥，即得重组虾青素。有益效果为：本发明该工程菌生长繁殖迅速、能成功表达出重组虾青素蛋白，表达量高、产量高，得到的重组虾青素为3S,3'S构型，工程菌发酵制备重组虾青素的产量高、效率高，大大节省人力物力成本。

技术领域

本发明涉及工程菌技术领域，尤其涉及重组微生物源天然虾青素基因工程菌及其产物的制备方法。

背景技术

虾青素，是广泛存在于自然界和海洋环境中的天然类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，呈深粉红色，素有“类胡萝卜素之王”的称誉。在过去的几十年，虾青素的市场价值主要体现在食品着色、家禽和水产养殖领域。最近，虾青素因为其潜在的抗氧化能力，在人类消费品领域引起了极大的关注和重视。它独特的化学结构可以跨越生物膜，作为抗氧化剂消除自由基，从而稳定细胞组织和结构。研究表明，虾青素对人体还具有增强免疫，进而抵抗炎症，延迟衰老，降低糖尿病和癌症发病风险的功能。在氧自由基吸收和淬灭单线氧能力上，虾青素的潜力远高于其他类胡萝卜素。正是因为虾青素在水产养殖、食品、化妆品和医药行业的应用极具扩张，它的市场价值被广泛看好。

目前，虾青素的生产有人工合成和生物获取两种方式。人工合成虾青素不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著。目前，最有前景的一种生产方式是微生物发酵，其中研究最为广泛的是红法夫酵母和雨生红球藻。雨生红球藻的虾青素含量可达细胞干重的3%，较红法夫酵母产量高，但是，由于其培养条件苛刻且提取困难，限制了其生产应用。红发夫酵母作为自然界中存在的天然生产虾青素的微生物，因为培养周期短细胞密度大等优势引起了人们的注意。天然存在的红发夫酵母中虾青素含量极低，受菌种的影响，产量在0.16~1.1mg/g之间浮动。Gerhard Sandmann等通过传统突变和代谢工程结合的办法，产生了一株虾青素干重达到9mg/g的菌株，是已知的产量最高的红发夫酵母。然而，由于红发夫酵母产生的虾青素为（3R,3′R）构型，抗氧化能力较低，限制了其在商业规模上的使用。因此，制备重组虾青素基因工程菌势在必行。

酵母的同源重组效率远远高于细菌或是其他的高等真核生物，酵母已作为一种工程菌操作平台，在途径工程和代谢工程领域被广泛用于生物化学途径的异源表达，同时染色体重组获得工程菌，具有遗传稳定，避免外源基因丢失的优点。Ken等使用酿酒酵母作为宿主菌，制备包含虾青素表达所需基因的多个质粒，然后导入宿主菌并生产虾青素（KenUkibe,Keisuke Hashida,Nobuyuki Yoshida,andHiroshi Takagi.MetabolicEngineering of Saccharomyces cerevisiae forAstaxanthin Production andOxidative Stress Tolerance.APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，2009:7205-7211）。然而，这种虾青素基因工程菌构建的方法需要依次将虾青素表达相关的基因整合于酵母菌染色体上，涉及多级克隆，且依赖于合适的酶切位点选择，操作繁琐，周期长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组微生物源天然虾青素基因工程菌及其产物的制备方法，该工程菌生长繁殖迅速、能成功表达出重组虾青素蛋白，表达量高、产量高，得到的重组虾青素为3S,3'S构型，工程菌发酵制备重组虾青素的产量高、效率高，大大节省人力物力成本。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

酿酒酵母INVSC1购于上海北诺生物科技有限公司。