[发明专利]反式茴香脑加氧酶突变体和突变株

说明书

本发明公开了反式茴香脑加氧酶突变体和突变株。所述反式茴香脑加氧酶突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其75位氨基酸Thr变为Met，331位氨基酸Phe变为Leu，所述反式茴香脑加氧酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。其合成对茴香醛、藜芦醛、洋茉莉醛、香兰素的转化速率分别为原始菌株的1.17、1.39、1.34、1.51倍，在生物法合成芳香醛香料中，展现了良好的应用潜力。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及反式茴香脑加氧酶突变体和突变株。

背景技术

丙烯基苯型精油单分是通过物理的方法从植物精油中提取的某一种丙烯基苯化合物，这类化合物的共同特征是具有丙烯基侧链，并且在苯环上具有甲氧基取代基团，常被作为合成带有苯环结构的名贵香料和药物的起始物(如香草醛、洋茉莉醛、茴香醛等)。由于化学合成香料在香料生产上存有：香料化合物中残留的化学物质给人体健康带来危害、化学合成会带来环境的污染、化学合成反应立体选择性差而导致产物为外消旋体等的缺陷。目前，生物合成香料化合物的技术越来越受到人们的关注。

反式茴香脑加氧酶(TAO)，由Han等人最先在恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaJYR-1中发现，该酶能氧化反式茴香脑合成对茴香醛，同时也能氧化异丁香酚、异黄樟素和对甲氧基异丁香酚，但催化效率不高，E.coli BL21(DE3)(pET-TAO)在含0.5mmol·L^-1的葡萄糖和1mmol·L^-1的不同底物溶液中,反应6h，能分别合成0.63mmol·L^-1对茴香醛和香草醛、0.38mmol·L^-1的洋茉莉醛和藜芦醛。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种反式茴香脑加氧酶突变体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种反式茴香脑加氧酶突变体，其中：所述反式茴香脑加氧酶突变体与野生型反式茴香脑加氧酶氨基酸序列相比，其75位氨基酸Thr变为Met，331位氨基酸Phe变为Leu，所述反式茴香脑加氧酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的一种优选方案：所述反式茴香脑加氧酶突变体，其是通过以反式茴香脑加氧酶基因为模板，进行易错PCR，获得反式茴香脑加氧酶突变体文库，并将所述反式茴香脑加氧酶的反应底物添加入含有反式茴香脑加氧酶突变体的溶液中进行催化反应，将反应液与2,4-二硝基苯肼进行显色反应，并加入碱溶液及有机溶剂反应，测定吸光度后筛选得到。

作为本发明所述的反式茴香脑加氧酶突变体的一种优选方案：所述易错PCR，包括设计易错PCR引物，所述易错PCR引物为：

taoF：TTCCAGGGGCCCCTGGGATCCGGATCCATGGAGGACATCATGC

taoD：GTCACGATGCGGCCGCTCGAGCTCGAGTCAGTTAGTCCTCAAGTCG。