[发明专利]一种基于CRISPR技术特异性检测人KRAS基因2号及3号外显子突变的crRNA

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR技术特异性检测人KRAS基因2号及3号外显子突变的crRNA，其特征在于，包括CRISPR‑Cas13a系统，还包括可与CRISPR‑Cas13a系统结合的crRNA，所述crRNA序列格式为：5`‑Cas13a蛋白锚定序列‑crRNA向导序列‑3`，本发明的优点在于，所述检测结果可通过荧光读数直观判断人KRAS基因是否发生突变，而无需高通量测序，具有成本低、可多次重复检测、检测速度快，结果可直观分析等优势，适用于大规模的临床样本检测，本发明公开的核酸检测技术与以往的基于PCR技术的检测技术不同，反应全程无需复杂的温度控制仪器或系统；通过将三步反应全部加入在一个反应体系中，进一步简化操作流程，可以在两个小时内检测出具有特异序列的核酸片段。

技术领域

本发明涉及一种生物材料的检测，具体地说，涉及一种基于CRISPR-Cas13a技术适用于快速检测生物样本中特异性核酸片段的方法。

背景技术

从基因水平上对疾病进行研究和诊断，是实现个体化精准医疗这一医学概念的关键，Kras 是一种鼠类肉瘤病毒癌基因，ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种—H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。K-ras因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，K-Ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。

目前常规的基因检测通过PCR技术实现，但现有的PCR技术存在一些缺陷如灵敏度不高、特异性不强、目的片段常采用DNA等，而造成成本高、重复性不强、检测耗时久等问题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测人KRAS基因2号及3号外显子突变的crRNA。

一种基于CRISPR技术特异性检测人KRAS基因2号及3号外显子突变的crRNA，包括CRISPR-Cas13a系统，还包括可与CRISPR-Cas13a系统结合的crRNA，所述crRNA序列格式为：5`-Cas13a蛋白锚定序列-crRNA向导序列-3`。

所述Cas13a蛋白为Lw Cas13a，所述crRNA序列中的锚定序列为

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC，

所述crRNA序列分别为

KRAS-EXON2

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUUGCCUACGCCACCAGCUCC AACUA

KRAS-EXON3

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUACUCCUCUUGACCUGCUG UGUCGA；

所述用于转录crRNA的脱氧核酸序列为

KRAS-EXON2

TAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC

KRAS-EXON3

TCGACACAGCAGGTCAAGAGGAGTACGTTTTAGTCCCCTTCGTTTTTGGGGTAGTCTAAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC。

所述Cas13a蛋白为Lsh Cas13a，crRNA序列中的锚定序列为