[发明专利]SHP-1敲除的T细胞及其构建方法

说明书

本发明公开了SHP‑1敲除的T细胞及其构建方法。发明人发现，通过将T细胞中的SHP‑1内源性阻断，可以有效提高T细胞对肿瘤的杀伤作用，为肿瘤免疫疗法提供了新的靶点。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫学、分子生物学、细胞生物学和基因编辑技术领域，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9系统制备SHP-1敲除T细胞的方法。

背景技术

免疫检查点阻断治疗在肿瘤的治疗中显示出惊人的疗效。临床试验发现，免疫检查点阻断治疗可以重新激活耗竭T细胞的效应功能，提高T细胞的抗肿瘤活性。免疫检查点阻断治疗主要利用抗体来阻断免疫检查点分子与其相应抗体之间的相互作用来提高T细胞的抗肿瘤能力。最常见的免疫检查点分子是PD-1和CTLA-4。免疫检查点阻断治疗已经在多种肿瘤的治疗中取得显著成效，其中包括黑色素瘤、非小细胞性肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌以及错配修复缺陷的肿瘤[1]。靶向CTLA-4的抗体ipilimumab已经获批用于晚期黑色素瘤病人的治疗中，其中20％接受过抗体治疗的病人，生存期在三年以上。近日，PD-1的抗体nivolumab和pembrolizumab以及PD-L1的抗体atezolizumab也获得FDA批准，用于晚期黑色素瘤、非小细胞性肺癌以及肾癌的治疗中。部分患者在接受免疫检查点阻断治疗后，表现出部分缓解或者是完全缓解，然而，并不是所有的病人对CTLA-4和PD-1抑制剂的治疗都有反应。

T细胞中磷酸酶的存在对T细胞的功能发挥具有重要的调节作用。T细胞通过TCR-MHC复合物识别抗原之后，胞内大量信号分子会被Lck、ZAP70等激酶磷酸化而激活，参与信号的传递。然而为了维持稳态、防止T细胞的过度激活，T细胞中大量抑制性磷酸酶也会被激活，造成信号分子的去磷酸化而失活，影响了T细胞激活信号的传递，最终削弱了T细胞的杀伤功能[2]。细胞中有一百多种PTP磷酸酶，即使人类T细胞也含有至少45种，并且越来越多的实验证据表明这些磷酸酶往往具有独立而无可替代的作用。因此，虽然理论上适当抑制T细胞中磷酸酶的活性有可能会提高T细胞清除肿瘤细胞的能力，但是同样的，不当抑制T细胞中磷酸酶的活性，特别是关键磷酸酶的活性，可能会导致难以预见的不利后果，对免疫系统的影响未知，甚至引发自身免疫性疾病的发生。选择其中的哪一种作为我们的靶点也是一个共认的难题[2]。另外，由于PTP磷酸酶是胞内蛋白，无法通过如PD-1、CTLA-4那样的抗体阻断剂实现对其功能的阻断；磷酸酶的小分子抑制剂也往往缺乏对酶或者细胞的特异性，导致临床上毒副作用很大。这些原因也都增加了人们进行选择和操作的难度。

T细胞是终末分化的原代细胞，很难进行转染或感染等基因操作，再加上其增殖能力有限，这就限制了在体外对T细胞进行基因操作，尤其是基因的敲除。近几年，基因编辑技术的革命性发展为T细胞免疫治疗提供了契机。利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑操作简单、效率高、特异性强，这使得在体外对T细胞进行基因编辑逐渐由可能变为现实。

参考文献：

1.Topalian SL,Drake CG,Pardoll DM.(2015)Immune checkpoint blockade:acommon denominator approach to cancer therapy.Cancer Cell.27(4):450-461

2.Mustelin T,Vang T,Bottini N.(2005)Protein tyrosine phosphatases andthe immune response.Nat Rev Immunol.5(1):43-57.。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种SHP-1敲除的T细胞及其构建方法。

本发明的另一个目的在于提供一种SHP-1敲除的CAR-T细胞及其构建方法。

本发明所采取的技术方案是：