[发明专利]一种鸡安卡拉病LAMP引物组、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供了一种鸡安卡拉病LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。所述鸡安卡拉病LAMP试剂盒包括2×反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP 40μmol/L各1.0μL，外引物F3、B3 5μmol/L各1.0μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，荧光染料Ⅰ0.5μL，以及环引物LF、LB 20μmol/L各1.0μL。所述试剂盒的检测方法，包括步骤：1)提取DNA模板；2)将LAMP反应体系与2.0μL的DNA模板混合，补水至25μL，然后加入20.0μL的石蜡油；3)通过Real‑Time PCR System设定反应条件63℃，30s，1个循环；60s，40个循环；每次循环结束时收集荧光信号。其引物组根据GenBank中公布的FADV‑4的核苷酸序列而设计，反应时间比Taqman法可缩短20min以上，而且无需额外购置专用实验仪器或耗材，适配度高。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种鸡安卡拉病LAMP引物组、试剂盒及其检测方法。

背景技术

心包积水综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)又称鸡安卡拉病，病原为鸡腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)，属于无囊膜的线性单分子双股DNA病毒。FAdV血清型众多，分别为血清型1～7，8a，8b，9～11共12种，不同血清型会导致不同程度的包涵体肝炎。其中血清4型强毒株对雏鸡的致病能力较强，是导致HPS发生的主要原因。腺病毒科(Adenoviridae)分五个属，禽腺病毒属(adenovirus)是其中之一，禽腺病毒属又分为禽腺病毒A～E、鹅腺病毒A、隼腺病毒A、及火鸡腺病毒B共8个种。FAdV-4和FAdV-10同属于禽腺病毒C。

FAdV呈世界性分布，1987年在安卡拉镇首次发生了鸡安卡拉病，1989年也报道了在墨西哥该病的发生，随后在印度、伊拉克、秘鲁、智利、厄瓜多尔、俄罗斯等地该病陆续的暴发。2015年6月以来，我国多数省份也发生了此类症状。该病的临床症状为发病鸡常表现为食欲不振、贫血、粗乱的羽毛、鸡冠颜色变浅、嗜睡发生率增高等，死亡率高达30％-90％，造成巨大的影响和经济损失。发病鸡主要表现为精神沉郁、羽毛逆立、排黄色稀粪，突然倒地后两腿划空，数分钟内死亡，剖检可见心包积有淡黄色透明的渗出液；肝脏肿胀、充血、质地变脆，色泽变暗，并出现坏死；肾苍白或暗黄色。

2000年日本的科学家Notomi等人发明了一种新的核酸扩增技术环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，LAMP的特征是针对目标DNA链上的6个区段设计4条不同的引物(FIP,BIP,F3,B3)，在链置换Bst DNA聚合酶的作用下于恒温60℃-65℃扩增60min左右，即可进行循环扩增，且效率可达10⁹-10¹⁰个数量级。LAMP反应具有较高的专一性，只有4条引物在靶基因中的6个不同区域完全匹配才能进行扩增。LAMP反应产物的检测手段多种多样，有琼脂糖凝胶电泳检测、限制性酶切鉴定、白色沉淀肉眼观察法、实时浊度定量检测、钙黄绿素做荧光指示、SYBR Green I染色观察方法和核酸试纸条检测等。

发明内容

本发明旨在提供提供一种简便快捷，对FAdV灵敏、特异的LAMP引物组。

本发明所采取的技术方案是：

一种鸡安卡拉病LAMP引物组，包括引物FIP、BIP、F3、B3、LF和LB，各引物的序列如SEQ ID№1～6所示。

上述引物组可应用于鸡安卡拉病LAMP检测试剂盒。

所述鸡安卡拉病LAMP检测试剂盒，具有LAMP反应体系，包括：

2×反应液RM 12.5μL，内引物FIP、BIP 40μmol/L各1.0μL，外引物F3、B3 5μmol/L各1.0μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，荧光染料Ⅰ0.5μL。