[发明专利]一种高效生产苯丙酮酸的方法

说明书

本发明公开了一种高产苯丙酮酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过构象动力学工程方法改造奇异变形杆菌来源的氨基酸脱氨酶，改造后的氨基酸脱氨酶基因连接于pET 20b载体，在E.coli BL21(DE3)中表达。发酵罐培养重组菌株，收集湿菌体转化丙氨酸生产苯丙酮酸，当湿菌体添加量30g/L，转化12h苯丙酮酸产量可以达到72.5g/L，苯丙氨酸的摩尔转化率达到96.7％。

技术领域

本发明涉及一种高产苯丙酮酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯丙酮酸(PPA)是一种双羟基化合物，分子式为C₉H₈O₃，结构式如图1。PPA常用于医药、轻工和化工等领域，可以用于制作复方α酮酸片；PPA是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物和食品添加剂的合成中间体；PPA还可以用于制备苯乳酸，苯乳酸可以用于抗菌防腐和风味添加剂。

PPA作为一种多功能有机酸，目前主要使用化学合成法生产，通常有α-乙酞氨基肉桂酸水解、乙内酰脲与苯甲醛合成法和氯苄经双羟基化反应三条路线。α-乙酰氨基肉桂酸水解制备苯丙酮酸的方法，其合成路线是甘氨酸先制成乙酰甘氨酸，再和苯甲醛缩合，生成的内酯，水解后得乙酰氨基肉桂酸，酸化得苯丙酮酸，产品得率只有50％，该法工艺成熟，设备简单，但由于在内酯合成苯甲醛和醋酐有一部分发生Perkin反应，产生肉桂酸副产物，苯甲醛部分聚合产生油性杂质造成内酯分离困难，导致该方法生产成本高。乙内酰脲与苯甲醛合成法在含有少量氨基酸的水溶液中，苯甲醛和乙内酰脲缩合成亚苄基乙内酰脲，然后用碱液水解生成的亚苯基乙酰脲而得苯丙酮酸钠，原料易得，价格低廉，但是反应温度在100℃左右，且排放大量工业废水。双羰基化法合成苯丙酮酸一般是以氯苄为原料，在过渡金属络合物催化作用下，以Ca、Mg、Ba等碱土金属的弱碱为中和剂，在弱极性溶剂中与一氧化碳反应而得到，此反应需要在高压条件下进行，设备投资大，反应时间长。化学合成法反应条件要求高，产品的的得率低，且会产生有毒有害物质，因此找到高效绿色的生产方法受到广泛关注。

PPA的生物法生产可以采用直接发酵法和酶转化法生产。根据文献报道，鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和摩氏摩根菌(Morganella morganli)可以直接发酵生产PPA，其中P.vulgaris通过分批发酵产量可以达到3.0g/L。由于菌体内PPA的路径较长，代谢路径酶活低，直接发酵法PAA产量低，且发酵液中含有大量菌体、蛋白质、无机盐等杂质，PPA的下游分离纯化工艺复杂。酶转化法可以利用苯丙氨酸脱氢酶、氨基酸转移酶和和L-氨基酸脱氨酶转化L-苯丙氨酸生产苯丙酮酸。

目前报道产量最高的是在大肠杆菌BL21中异源表达奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)来源的L-氨基酸脱氨酶，使用全细胞转化PPA产量可以达到58.4g/L。

发明内容

为了解决上述问题，本发明旨在通过基因工程手段改造氨基酸脱氨酶，提高PPA的生产能力，缩短转化周期，减少湿细胞的添加量可以进一步降低PPA的生产成本。本发明提供了一种通过构象动力学工程改造得到高酶活力氨基酸脱氨酶的方法，并应用基因工程菌株全细胞转化生产苯丙酮酸的方法，该方法湿菌体用量少、生产强度大、转化效率高，适用于工业化生产苯丙酮酸。

本发明的第一个目的是提供一种氨基酸脱氨酶的突变体，所述突变体的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:4所示。

本发明的第二个目的是提供编码上述氨基酸脱氨酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达本发明的氨基酸脱氨酶突变体。