[发明专利]一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法

说明书

本发明为一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其通过筛选不同的细胞外基质以及将化学小分子物质应用于猪的精原干细胞长期培养，在体外可将猪的精原干细胞培养至三个月。本发明以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，对不同的化学小分子组合进行筛选，通过添加Chir99021，Repsox以及CD脂质浓缩物，将猪的精原干细胞体外培养至三个月并维持较好精原干细胞特性。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法。

背景技术

中国是世界上养猪最多的国家之一，由于猪与人的亲缘关系近，其生理生化指标与人类相似，因而经常被用来研究人类的生殖发育机制。

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSC)是哺乳动物体内唯一可以将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。在早期研究中，SSCs一直被认为是单能的，而实际上SSC在培养过程中能够自主重编程形成ES样多潜能干细胞，尽管自发重编程的效率相对较低，因此，精原干细胞也被认为是一种多潜能细胞的理想来源，其可以向多种细胞类型分化，包括平滑肌细胞、血管内皮细胞、卵母样细胞、肝干细胞样细胞、肾实质细胞、神经元样细胞、神经上皮样细胞等。

如今，体外培养小鼠以及一些别的物种的精原干细胞已经实现。1998年，Brinster等首次报道了关于精原干细胞的长期培养，研究表明，过表达GDNF会使精原细胞快速增殖，而干扰GDNF则会使精原细胞数量减少，这项发现随后迅速促进了精原干细胞培养基的优化与筛选。筛选行之有效的精原干细胞体外培养体系对于研究精子发生相关的作用机制必不可少。截止到目前，已报道的主要有四种小鼠精原干细胞的培养体系，而猪等家养动物长期培养SSCs的稳定体系还没有建立，特别是当SSCs进行无饲养层培养时。猪作为一种重要的模式动物，建立和完善猪精原干细胞(pSSC)的培养体系非常重要。已有的精原干细胞长期培养体系并不能完全实现猪精原干细胞的体外长期培养，因此我们需要优化pSSCs的体外培养体系，为探索其生物学特性奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其通过筛选不同的细胞外基质以及将化学小分子物质应用于猪的精原干细胞长期培养，在体外可将猪的精原干细胞培养至三个月。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，将猪的精原干细胞体外培养至两个月并维持较好精原干细胞特性。

一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于：以2D赛天然人工合成多肽基质涂层作为一种胞外基质，在培养过程中观察到典型的葡萄串珠状精原干细胞簇，对不同的化学小分子组合进行筛选，通过添加Chir99021，Repsox以及CD脂质浓缩物，将猪的精原干细胞体外培养至三个月并维持较好精原干细胞特性。

所述的的2D赛天然人工合成多肽基质涂层为一种商品化的人工合成的多肽，应用于猪的精原干细胞的无饲养层培养。

一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法，其特征在于包括以下步骤：

1)猪睾丸原代细胞的分离：

采用两步酶消化法，经连续两次差异贴壁，通过多能性干细胞染料CDy1对分离富集得到的猪精原干细胞鉴定；

2)精原干细胞的培养与传代：