[发明专利]抗EpCAM嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用

权利要求书

1.抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：其至少包含了EpCAM结合区和CTLA4结合区，且同时包含了位于两者之间的T2A核酸人工序列。

2.如权利要求1所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：还包含有跨膜-刺激结构域。

3.如权利要求2所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域选自CD8、CD27、CD28、CD226、4-1BB、OX40、ICOS分子的全部或部分片段。

4.如权利要求3所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：包括顺序连接的

Leader核酸人工序列，如SEQ ID NO.2所述，

EpCAM结合区核酸人工序列，如SEQ ID NO.3所述，

CD8 Hinge区核酸人工序列，如SEQ ID NO.5所述，

CD8跨膜区核酸人工序列，如SEQ ID NO.6所述，

跨膜-刺激结构域，

CD3ζ胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.9所述，

T2A核酸人工序列，如SEQ ID NO.4所述，

Leader核酸人工序列，如SEQ ID NO.2所述，

CTLA4结合区核酸人工序列，如SEQ ID NO.10所述，

CD8 Hinge区核酸人工序列，如SEQ ID NO.5所述，

CD8跨膜区核酸人工序列，如SEQ ID NO.6所述，

CD3ζ胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.9所述。

5.如权利要求4所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域采用CD226与4-1BB核酸人工序列，其中，

CD226胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.7所述，

4-1BB胞内区核酸人工序列，如SEQ ID NO.8所述。

6.制备如权利要求5所述抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：

分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)。

将pUC57-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)进行双酶切，利用琼胶电泳将含有scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)DNA片段，即为所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因。

7.质粒，其特征在于：具有如权利要求5所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，且采用包括如下步骤的方法制备得到：

分别按融合基因片段Leader-scFv(EpCAM)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-C-GFP载体NotI-AsiSI位点，转化到E.coli Top10，通过菌液PCR鉴定后，使用质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-scFv(EpCAM)-T2A-scFv(CTLA4)。

8.免疫细胞，其特征在于：具有如权利要求5所述的抗EpCAM嵌合抗原受体编码基因，且所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、CIK细胞、T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞的任意一种。