[发明专利]抗GCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用

权利要求书

1.抗GCC的核酸，其特征在于：至少包含Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的抗GCC的核酸，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列选自CD8、CD27、CD28、4-1BB、CD134、ICOS分子的全部或部分DNA片段。

3.如权利要求2所述的抗GCC的核酸，其特征在于：其包括依序排列的

如SEQ ID NO.2所述的Leader核苷酸序列；

如SEQ ID NO.3所述的GCC单链抗体核酸人工序列；

如SEQ ID NO.4所述的CD8的铰链区核苷酸序列；

跨膜-刺激结构域核苷酸序列；

如SEQ ID NO.6所述的4-1BB胞内区核酸序列；

如SEQ ID NO.7所述的CD3ζ信号传导区核苷酸序列；

如SEQ ID NO.8所述的自裂解肽T2A核酸人工序列；

如SEQ ID NO.9所述的趋化因子IL7核苷酸序列；

如SEQ ID NO.10所述的趋化因子CCL19核苷酸序。

4.如权利要求3所述的抗GCC的核酸，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列采用如SEQ ID NO.5所述的CD8跨膜区核酸人工序列。

5.如权利要求4所述的抗GCC的核酸，其特征在于：所述抗GCC的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

6.制备如权利要求1所述核酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)分别按Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-GCC-CAR；

(2)将pUC-GCC-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将GCC-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的GCC-CAR DNA片段。

7.免疫细胞，其特征在于：包含具有如上所述核酸的质粒。

8.如权利要求7所述的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。

9.如权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于：所述质粒是将融合基因片段GCC-CARDNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-GCC-CAR质粒；再将上述的pLent-GCC-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。

10.抗GCC核酸在制备治疗实体瘤药物中的应用。