[发明专利]一种脐血单个核细胞冻存液及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种脐血单个核细胞冻存液及其应用。本发明提供的一种脐血单个核细胞冻存液，包括二甲基亚砜(DMSO)联合羟乙基淀粉(HES)、丙二醇、人白蛋白、缓冲液，该方案相比传统配方，可避免动物源性病原体的污染，同时避免采用细胞培养基作为冻存液组成成分，并保证了良好的细胞冻存效果，冻存2个月后，用本发明冻存液冻存的CBMC复苏后细胞活率平均值为97.47％～98.43％。细胞复苏后可直接进行临床移植，在细胞治疗临床应用方面颇具实用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种脐血单个核细胞冻存液及其应用。

背景技术

脐血单个核细胞(cord blood mononuclear cell，CBMC)，指脐血中具有单个核的细胞，包含造血干细胞、淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞和其它少量细胞。CBMC在体内可促进机体造血，增强机体免疫力；在体外可诱导分化成多种免疫细胞，如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤性T细胞(NKT)，在抗肿瘤、抗感染等方面具有重大用途。因此，冻存CBMC在细胞治疗方面具有很重要的意义。

细胞冻存是细胞长期保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于

-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

细胞冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。为了将细胞冻存、复苏过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程，但需要在冻存前加入一种或一种以上的冻存保护剂，在溶解后又将其去除。目前最常用的冻存保护剂为二甲基亚砜(DMSO)，这种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，减少胞内形成冰晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。由于高浓度DMSO对细胞有毒性，还必须添加其他的液体成分，如血清、细胞培养基，以降低DMSO的浓度，减少对细胞的伤害。

现有冻存CBMC的冻存液配方多采用DMSO联合动物血清，具有传播病原体的潜在隐患，而采用培养基则限制了其在临床上直接应用的可能性。目前干细胞冻存液所使用的胎牛血清常携带动物源性病毒，比如欧洲多个国家发生疯牛病，其血清中含有导致疯牛病的病毒，用于冻存细胞会导致此类病毒传播。此外，有研究表明长期与胎牛血清接触的干细胞会对溶液介质中的胎牛血清发生内吞，内吞胎牛血清后的干细胞有可能发生某些蛋白表达的变化，应用于人体后有可能发生异种动物蛋白引起的免疫反应，从而导致干细胞移植后成功率降低以及不良反应的发生。因此，中国药品和食品质量监督管理局2003年发布的《人体细胞治疗临床研究和质量控制指导原则》明确指出，应尽量避免使用动物血清培养细胞。

细胞培养基也是目前的冻存液配方中常见的成分，其成分复杂，不能直接注射入人体，故如果需要细胞复苏后直接移植，则必需通过离心把细胞培养基去除掉，而离心又会导致刚刚复苏的细胞受损，活率降低，影响细胞治疗效果。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种脐血单个核细胞冻存液、应用、制备方法。本发明的CBMC冻存液不采用动物血清，避免了血清传播动物源性病原体的风险。而且，采用本发明的冻存液，细胞复苏后活率更高，显示其更好的冻存效果。此外，本发明的CBMC冻存液配方不含培养基，细胞复苏后可直接用于临床回输，提高了其在临床应用方面的价值。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种脐血单个核细胞冻存液，包括如下组分：