[发明专利]细胞冻存组合物及其应用

说明书

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存组合物及其应用。本发明在细胞冻存液中使用抗冻蛋白、DMSO、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖和勃脉力A，显著的提高了细胞的存活率，达到96％以上，这在干细胞、神经细胞等稀少细胞的保存上有很重要的意义，同时也降低了细胞复苏后细胞培养的成本，缩短了细胞培养的周期。

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存组合物及其应用。

背景技术

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。

冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是写大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。

现有的技术多是使用DMSO或者甘油等作为冻存的保护剂，但是复苏后细胞的存活率并不是很好，通常情况下，在50％左右。因此，提供一种复苏后细胞的存活率较高的细胞冻存液具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种细胞冻存组合物及其应用。本发明提供的细胞冻存液使用抗冻蛋白、DMSO、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖和勃脉力A，可以显著的提高存活率，达到80％以上，这在干细胞、神经细胞等稀少细胞的保存上有很重要的意义，同时也降低了细胞复苏后细胞培养的成本，缩短了细胞培养的周期。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了抗冻蛋白在制备冻存液中的应用。

抗冻蛋白AFPs(Antifreeze proteins)：一类具有提高生物抗冻能力的蛋白质类化合物的总称。现已发现五种，包括抗冻糖蛋白、抗冻蛋白Ⅰ、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ、抗冻蛋白Ⅳ。