[发明专利]核酸适体酶联检测试剂盒和制备方法及其应用

说明书

本发明涉及核酸适体酶联检测试剂盒和制备方法及其用途，该核酸适体酶联检测试剂盒，包括核酸适体板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、酶标抗体、洗涤液、显色液A&B、终止液和封口膜；其中，核酸适体板为VEGF核酸适体修饰的酶联板；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记血管内皮细胞生长因子单克隆抗体。本发明的核酸适体酶联检测试剂盒具有结果稳定准确、特异性强、灵敏度高、使用方便、价格低廉、便于推广的优点。

技术领域

本发明涉及一种基于核酸适体的人血管内皮生长因子(VEGF)的酶联检测试剂盒及其制备。

背景技术

1990年，美国哈佛大学Folkman博士提出著名的Folkman理论，肿瘤组织生长，必须依靠新生血管生成提供足够的氧气和营养物质来维持。2000年Hanahan和Weinberg在Cell综述了肿瘤细胞具有六种获得性能力，并列举了各自的可能机制，其中也提到了“持续血管生成是肿瘤的重要标志之一”。而血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是最有效的血管形成因子之一，对内皮细胞具有特异性分裂能力。VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白。两条分子量各为24kDa的单链以二硫键组成二聚体。其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。

一般肿瘤患者确诊时都到了中晚期，早期筛查并对可疑患者或无症状患者及时诊断，可以提高肿瘤患者的生存率，延长生存时间。早发现和早治疗是肿瘤筛查的重要意义。肿瘤分子诊断试剂多作为基因突变位点的检测，变异的肿瘤细胞产生即可测出。但部分正常人群中存在处于休眠状态的肿瘤细胞，有些休眠期可长达10年，此时测出无法确诊，只能做为肿瘤风险性评估，不具筛查意义，并且会对筛查对象产生极大忧患。目前在应用的肿瘤标志物绝大多数对应1-3种肿瘤，特异性大多在75％左右，敏感性在30％-90％，筛查时多选择几种常见的肿瘤标志物组成体检套餐，筛查广谱性不够且检验费用较高。VEGF被认为是最有意义的血液肿瘤筛查的标记物。VEGF可筛查几乎所有实体肿瘤，它的广谱性是其他检测指标不可替代的。此外，VEGF参与许多血管生成依赖性疾病的发病及其进展，除了癌症外，还包括某些炎性疾病(如类风湿性关节炎)以及糖尿病视网膜病变等。

目前血清VEGF的检测主要有基于抗原抗体识别的酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受抗体的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，临床上只能手工操作，工作量大而且还易产生人为误差，此外还有一定的放射性污染。为了提高血清VEGF的检测灵敏度，国内有公司采用了VEGF受体和单克隆抗体同时固定到酶标板上，以此增加VEGF的捕获效率提高灵敏度达到pg/ml(北京健平九星生物医药科技有限公司)，然而昂贵的VEGF受体使得试剂盒价格大幅提高。此外，也有文献报道采用多步信号放大方法提高灵敏度(Biosensors and Bioelectronics,2016,86,990–995；Biosensors and Bioelectronics,2017,89,964–969)，但因为操作过程复杂，无法实现临床上的试剂盒制作。因此，开发出一种简单快速、灵敏度高、价格便宜、易于制作成临床检测试剂盒的VEGF方法在临床诊断中具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为解决以上问题的至少一个，本发明提供一种基于核酸适体的人血管内皮生长因子(VEGF)的ELISA检测试剂盒。该试剂盒具有结果稳定准确、特异性强、灵敏度高、使用方便、价格低廉、便于推广的优点。

根据本发明的一个方面，提供一种核酸适体酶联检测试剂盒，包括核酸适体板、阴性对照、阳性对照、样品稀释液、酶标抗体、洗涤液、显色液A&B、终止液和封口膜。

其中，核酸适体板为VEGF核酸适体修饰的酶联板；酶标抗体为辣根过氧化物酶标记血管内皮细胞生长因子单克隆抗体。

其中，阳性对照为人血管内皮细胞生长因子蛋白冻干粉；阴性对照为动物血清冻干粉。