[发明专利]一种离体培养提高甜叶菊RM含量的方法

说明书

本发明公开了一种离体培养提高甜叶菊RM含量的方法,属于细胞学和生物学领域，主要包括以下步骤：(1)以甜叶菊叶片为外植体，接种到愈伤组织培养基；(2)产生绿色愈伤组织后，转入芽诱导培养基；(3)产生幼芽后，转入生根培养基,诱导产生大量根系后，按常规继代培养和扩繁。利用本发明提供的离体培养提高甜叶菊RM含量的方法,经过培养后甜叶菊RM含量增加显著，培养过程中各培养基也容易获得，培养过程简单易实施。

技术领域

本发明属于细胞生物学和生物领域，具体涉及甜叶菊(SteviarebaudianaBertoni)离体培养提高甜叶菊叶片中RM含量的方法。

背景技术

甜叶菊(Stevia rebaudianaBertoni)又名“甜菊”、“甜草”是一种小型多年生菊科(Compositae)斯台维亚属草本植物，原产于南美巴拉圭高原，几个世纪以来甜叶菊一直被当地居民作为甜味饮料饮用从甜叶菊叶片中提取出来的糖苷以其高甜度、低热量、安全无毒等特点，逐渐受到糖尿病、肥胖症患者的青睐。

目前，已有研究表明甜菊糖苷类物质有莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，RA)、RB、RC、RD、RE、RF、RM以及甜菊苷(Stevio Glycoside，SS)等多种化合物。甜菊糖苷的化学成分由双萜苷元(非糖体部分)和糖基(主要是葡萄糖)组成。甜菊糖苷的甜味和苦味是由人体舌头味觉细胞上的糖受体和苦味受体对甜菊糖苷中的非糖体和葡糖基所识别而感觉到。其中，甜味和苦味主要由非糖体部分和C₁₃、C₁₉位的R₁和R₂上的糖基数量决定。从甜菊糖苷的口感来分析，糖基多的甜菊糖苷RA和RM比糖基少的甜菊糖苷ST味道更甜。甜叶菊中的甜菊双糖苷RM，甜度高于甜菊双糖苷RA，而苦味比甜菊双糖苷RA和ST弱，因而有望在将来有更广的利用。但甜叶菊中的RM含量少，供不用求，所以，如何提高RM的产量成为了关键的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种离体培养提高甜叶菊RM含量的方法，属于细胞学和生物学领域，其能够快速获得RM含量高的甜叶菊组培苗，以解决现有技术中存在的问题。

本发明从甜叶菊生物合成途径角度分析，甜菊糖是由叶绿体内合成的贝壳杉烯，转运至内质网膜进而合成为甜菊醇，甜菊醇在液泡中合成为甜菊糖的各组分物质，甜菊醇在各种尿苷二磷酸糖基转移酶的作用下按步骤分别生成甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊糖苷及甜菊糖苷M(RM)，最终在液泡中大量积累储存。另一方面，本发明考虑到甜叶菊从叶片脱分化形成大量愈伤组织的过程中细胞内物质需要重新合成和分配。从上述RM生物合成途径角度可以推测，RM在细胞中的合成需要很多中间产物(如RA)作为底物合成的，那么外源提供RA也可能为细胞内的RM合成提供物质基础，以此来增加甜叶菊叶子中的RM含量。但是通过组织培养提高甜叶菊叶片RM含量的研究未见报道。因此，本发明尝试通过组织培养的方法，向各阶段培养基中添加外源RA，希望获得叶片中RM含量较高的甜叶菊株系。

本发明提供一种离体培养提高甜叶菊RM含量的方法,其主要过程如下：

(1)以甜叶菊叶片为外植体接种到愈伤组织培养基；其培养基组成为：MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.6mg/L 6-BA+0.6mg/L NAA+200mg/g RA；其组培室环境温度15-35℃(优选为25±1℃)，光强1500-3000Lux(优选为2000Lux)，光周期昼7-17h/夜7-17h(优选为光周期昼12h/夜12h)，愈伤组织培养时间为10-30天(优选为20天)。

(2)产生绿色愈伤组织后，转入芽诱导培养基，其培养基组成为：MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+200mg/g RA中；培养条件为温度15-35℃(优选为25±1℃)，光强1500-3000Lux(优选为2000Lux)，光周期昼7-17h/夜7-17h(优选为光周期昼光12h/夜12h)，芽诱导培养基培养的天数为15-40天(优先为30天)。