[发明专利]一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用

说明书

本发明公开了一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用，属于生物医药技术领域。本发明通过96孔板液体培养的方法，对文库中以BY4743为母菌株的4600多个单基因缺失株进行筛选，并且在添加2μg/mL克霉唑的YPD固体培养基上进行进一步倍比稀释验证，确定和野生型相比，mrx14、sls1、mrpl37、irc19、rml2五株菌对2μg/mL克霉唑具有抗性，进而对它们抗氧化活性进行了测定。从本发明五个酿酒酵母所缺失的基因作为研究基础出发，进行克霉唑的生产改良以及其他抗真菌新药物的研发，同时，也可找出其他致病真菌中和这五个基因同源的基因，得到单基因缺失株，用以验证克霉唑及其他新开发的抗真菌药物的临床效果。

技术领域

本发明涉及一种具有克霉唑抗性的酿酒酵母及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

目前，全球真菌感染率呈上升趋势，尤其是深部真菌感染日渐引起关注，真菌感染成为威胁人类生活质量和生命健康的重要病因之一。与之相反，临床上能够有效治疗真菌的药物种类相对有限，并且部分药物不良反应较大。

克霉唑(Clotrimazole，Clo)，化学名为1-[(2-氯苯基)二苯甲基]咪唑，是一种广谱抗真菌药物。克霉唑对多种致病真菌具有抗菌效果，尤其是对白念珠菌的临床效果较好，其抗菌作用机制为抑制真菌细胞膜中的麦角固醇等固醇的生物合成，从而损伤真菌细胞膜并且改变其通透性，也可抑制氧化酶和过氧化酶的活性，引起细胞内过氧化氢积聚导致细胞亚微结构变性和细胞坏死。对白色念珠菌的抗菌机制主要是抑制其具侵袭性的菌丝的形成。克霉唑目前主要供临床外用，尤其是对由白念珠菌引起的念珠菌性阴道炎具有较为明显的效果。

然而，由于近些年不规范使用抗菌药物，甚至滥用抗菌药物等因素，部分病原菌已经逐渐对现有的抗真菌药物产生了耐药性，有研究表明，白念珠菌对于唑类抗真菌药物的耐药率和最小抑菌浓度均有增高，从而使临床上的治疗更为困难，为了抑制白念珠菌，需要不断地提高抗真菌药物的剂量。现市面上出售的药物已难以满足临床抗真菌感染治疗的需求，尤其是那些多重耐药菌株引起的感染，经常因为无药可用而导致患者死亡。因此，对现有抗真菌药物不断改良，并且研发新的效果更好的抗真菌药物，是目前医药行业至关重要的一项课题。

此外，活性氧(reactive oxygen species,ROS)在调控细胞过程中有非常重要的作用，例如细胞凋亡、氧化应激等，目前也是分子医学和生命科学等最前沿的研究领域之一。研究发现，如果ROS在细胞中过量积累，会对细胞内的蛋白质、核酸等生物大分子造成氧化损伤，且研究发现由ROS引起的细胞内的氧化损伤和细胞程序性死亡与心脏病、肌萎缩侧索硬化症等疾病相关联，同时，ROS在细胞衰老的过程和在癌症的发展过程中起到至关重要的作用。

由于条件致病真菌白念珠菌和酿酒酵母的基因同源性较高，抗病机制相似，但白念珠菌没有单倍体，其遗传操作不如酿酒酵母容易。因此，很多白念珠菌的基因研究，都是先从酿酒酵母基因组出发，研究酿酒酵母基因的功能，从而再研究白念珠菌中同源基因的功能。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，隶属于半知菌亚门，芽孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，酵母属，也称啤酒酵母或芽殖酵母(budding yeast)，因其具有单细胞、繁殖快、有单倍体和双倍体两种状态存在等优点，被当做真核模式生物。酿酒酵母全基因组的测序完成及对其基因组和蛋白组学的研究探索，为其他真核生物尤其是高等生物及人类的基因组结构和功能的研究和探索提供了基础，尤其是为人类疾病的研究提供了模型。然而，目前酿酒酵母中哪些基因改变对抗真菌药物酮康唑具有抗性并不明确，无法有针对性的利用酿酒酵母对酮康唑药物进行改良。

发明内容

为了克服上述问题，本发明利用添加2μg/mL克霉唑的YPD培养基，对酿酒酵母基因缺失株进行大规模筛选，得到了五种对2μg/mL克霉唑具有抗性的基因缺失菌株，说明缺失该基因之后，2μg/mL克霉唑对其没有抗菌效果。因此，从这五个基因出发，用以改良克霉唑及新的抗真菌药物的研发，可以解决临床上一部分真菌抗药性的问题。