[发明专利]一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法

权利要求书

1.一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)种子液制备：种子液制备用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖5-20g/L、硫酸铵1-10g/L、磷酸二氢钾2-30g/L、硫酸镁0.1-5g/L和水，所述水为溶剂，所述种子液制备用培养基的pH为6.0-7.0，将大肠杆菌接种到所述种子液制备用培养基中，培养方法为：温度为20-37℃、搅拌转速为50-250rpm；

(2)上罐发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸：发酵用培养基包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖10-30g/L、硫酸铵3-30g/L、磷酸二氢钾1-20g/L、硫酸镁0.1-5g/L、硫酸锌0.5-5g/L、硫酸铜0.01-0.5g/L、硫酸锰0.5-5g/L、氯化钴0.1-2g/L、亚硒酸钠0.01-1g/L、维生素B10.005-0.5g/L、维生素B20.005-0.1g/L、维生素B60.005-0.3g/L和水，所述水为溶剂，所述发酵用培养基的pH为6.0-7.0，将步骤(1)所制得的种子液接种到发酵用培养基中，接种量为1-4％，发酵罐装液量为发酵罐容积的60-75％，培养方法为：温度为25-37℃，搅拌转速为180-600rpm，发酵开始1-3h后进行连续补料，补料速度为10ml/min，直至发酵结束，所述补料溶液总量为培养基总体积的10-30％，补料4-6h后，发酵液通过0.45μm滤膜连续移出发酵罐，移出速度为5ml/min，直至发酵结束，此过程持续6-12h，此过程结束后，发酵罐中剩余的发酵液通过离心机去除菌体，所述离心机的转速为3000-9000rpm，随后合并上述过程中所有的发酵液，利用高效液相色谱法检测所述发酵液中5-甲基吡嗪-2-羧酸的浓度为10-42g/L；

(3)超滤浓缩：将步骤(2)合并后的发酵液进行超滤浓缩，所选用的超滤膜分子量大小为1000-5000Da，收集超滤膜透过液，超滤浓缩的收率为98-100％；

(4)阳离子交换树脂分离纯化：采用阳离子交换树脂从步骤(3)中得到的超滤液中分离出含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的料液，所述料液吸附速率为0.05-0.5wt％/min、吸附温度为20-40℃，等料液吸附完毕后，用纯水洗去未吸附物，然后用50％的浓硫酸或浓盐酸将料液从阳离子交换树脂中洗脱下来，料液洗脱速率为0.05-0.5wt％/min、洗脱温度为20-40℃，本步骤的收率为98-99％；

(5)萃取、浓缩和固体烘干过程：用萃取剂萃取步骤(4)所得的洗脱液中的5-甲基吡嗪-2-羧酸，萃取方法为：萃取温度为20-30℃，萃取次数为2-5次，萃取剂的用量为洗脱液质量的0.5-3倍，萃取结束后，将含有5-甲基吡嗪-2-羧酸的萃取剂在77℃下进行蒸馏，除去萃取剂，析出的固体放入鼓风干燥箱中烘干即得5-甲基吡嗪-2-羧酸固体，利用高效液相色谱法检测所述5-甲基吡嗪-2-羧酸固体的纯度为99.5-100％，整个制备过程的总收率为90-96％。

2.根据权利要求1所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的补料溶液包括以下组分(以质量浓度计)：葡萄糖50-200g/L、2,5-二甲基吡嗪50-200g/L、阿拉伯糖1-10g/L和山梨糖醇0.5-10g/L。

3.根据权利要求2所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的阳离子交换树脂为强酸性阳离子交换树脂或弱酸性阳离子交换树脂，所述阳离子交换树脂的平均粒径为0.4-0.6mm、含水量为50-75wt％。

4.根据权利要求3所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇、异丁醇、正辛醇、异辛醇、2-丁酮、戊酮、正己烷、环己烷或甲苯中的一种。

5.根据权利要求4所述的一种利用重组大肠杆菌连续发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于：所述步骤(5)中的萃取剂为乙酸乙酯。