[发明专利]一株耐盐耐碱的具有广抑菌谱的枯草芽孢杆菌

说明书

一株耐盐耐碱的具有广抑菌谱的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)是从黑龙江大兴安岭林区土样分离得到的，其保藏编号为CGMCC15534。本发明的菌株可耐受高浓度盐(≤3％)和高pH(≤pH9.5)，并在此条件下能够发挥生物拮抗的功效，可替代化学药剂进行生物防治，解决设施大棚盐渍化土壤土传病害的问题，而且不污染环境对人畜也无害，具有较强的抗菌活性，低毒、安全，其可作为理想的生物防治资源，在盐碱地生物防治方面具有潜在的应用价值。在菌株的培养和生产方面，芽孢杆菌对营养的要求简单，形成抗逆的芽孢后易于保持活性和产品的储存，同时可制成可湿性粉剂、粉剂和液体等剂型便于使用。

技术领域 本发明涉及一种微生物。

背景技术

设施大棚的不合理肥料和栽培管理措施不当及设施大棚的自身特征，导致设施大棚土壤盐渍化日趋严重(盐渍土是盐土和碱土以及各种盐化、碱化土壤的总称)，同时由于不合理的轮作也导致了严重土传病害的发生。设施大棚由于温度较高，虫害发生较少，主要是土传病害发生严重，普遍发生的病害有：枯萎病、灰霉病、白粉病和角斑病等，这些土传病原菌可以通过植物残体越冬越夏，设施大棚的不合理轮作致使土壤中残留了大量的植物病害病原菌，植物病原菌由根部向茎尖发展，病原菌在维管束内繁殖，阻塞其输送营养物质，致使植株枯萎死亡，严重地影响了农业生产过程。目前，快速防治设施大棚病害的主要手段为泼洒化学杀菌剂，化学药剂的大量使用可导致长期的环境污染和对人体健康的危害。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够耐盐耐碱且具有较广土传病害抑菌谱的枯草芽孢杆菌Z58(Bacillus subtilis,B.subtilis)。本发明主要是提供一株枯草芽孢杆菌及其可耐盐耐碱并具有抑制多种植物病原菌的特征。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明提供的一株B.subtilis Z58已于2018年3月30日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC15534：

本发明所述的芽孢杆菌是从黑龙江大兴安岭林区土样分离得到的，其步骤如下：

1、菌株分离及鉴定

本发明提供的菌株分离自黑龙江大兴安岭林区土样，无菌取样袋带回，称取土样1g并加入到50ml无菌水中，最好无菌水中加入直径为20mm玻璃珠20粒，180rpm振荡20min。将振荡后的样品静置5min取上清，将上清转移至2ml灭菌离心管中，将离心管置于75℃-80℃水浴中热激处理10-15min，将热激后的溶液逐级梯度稀释到10^-1-10^-7，取100μl涂布于LB固体平板上，LB固体培养基配方为：酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，pH7.2-7.4，32℃培养48h，选取每个平板上生长50-100个单菌落的稀释梯度的平板，用牙签挑取320个菌落，三段划线纯化菌落。将纯化后的菌落点接种于已接种草莓根腐病的LB固体培养基上，选择对草莓根腐病具有较强拮抗作用的Z58菌株，对其进行菌株鉴定及后续研究。该菌株呈现革兰氏阳性、杆状、能产生芽孢，营养体大小为(0.6-1.0)╳1.2-2.5μm。将该菌株在LB液体培养基中培养(LB液体培养基配方为：酵母浸膏粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，pH7.2-7.4)，32-37℃ 180rpm，培养20-24h，10000g离心收集菌体，按照Tiangen细菌DNA提取试剂盒方法提取Z58菌株的总DNA，并进行PCR扩增16srDNA，扩增使用的引物分别为：

正向引物27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG；

反向引物1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T

PCR反应体系：DNA模板1μl、2×MastarMix10μl、27F 1μl、1492R 1μl，超纯水补足至20μl。