[发明专利]沉默荣昌猪CD14表达的siRNA及筛选方法与应用

权利要求书

1.一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA，其特征在于，所述小核糖核酸分子siRNA的序列信息为：

正义，AUUGUCAGAUAGGUCCAGGGU(5′–3′)；

反义，CCUGGACCUAUCUGACAAUCC(5′–3′)。

2.如权利要求1所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建重组表达质粒pCD14-EGFP；

步骤2，构建稳定表达荣昌猪CD14基因的CD14-EGFP稳定细胞系；

步骤3，根据CD14基因的序列，合成针对CD14基因的四个小干扰核糖核酸分子siRNAs；

步骤4，使用高效转染试剂，将步骤3中四条siRNAs转染步骤2的CD14-EGFP稳定细胞系；

步骤5，经过步骤4的转染36h后，利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测siRNA的抑制效果，从而筛选出其中能特异且最有效沉默荣昌猪CD14基因表达的siRNA。

3.根据权利要求2所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，其特征在于，所述步骤1具体为：

步骤1.1，根据猪CD14基因序列，同时参照pEGFP-N1载体信息，设计CD14真核表达引物F、R，并将pEGFP-N1载体多克隆位点上的Apa I和EcoR I分别作为上、下游引物的酶切位点；

其中，CD14真核表达引物F、R具体为：

F:5’-GCGCGGGCCCATGGTGAGTGTGTGCACGAGG-3’；

R:5’-CGCGGAATTCTTAGGCGAAGCCCCGGG-3’；

所述真核表达引物F、R中下划线位置处分别为pEGFP-N1载体多克隆位点上的Apa I和EcoR I的上、下游引物的酶切位点；

步骤1.2，以cDNA为模板，取步骤1.1中真核表达引物F、R进行降落PCR扩增CD14 CDS编码区，随后将扩增出的目的片段电泳，最后纯化回收扩增出的目的片段；

步骤1.3，将步骤1.1的pEGFP-N1载体与步骤1.2的目的片段同时经Apa I和EcoR I双酶切消化，经电泳回收到线性化载体与扩增产物；然后在T4DNA连接酶的介导下4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经IPTG蓝白斑筛选，挑取单克隆进行菌落PCR初步鉴定，将阳性重组子摇菌，提取质粒，Apa I和EcoR I双酶切鉴定，测序得到重组表达质粒pCD14-EGFP。

4.根据权利要求3所述的一种沉默荣昌猪CD14表达的siRNA的筛选方法，其特征在于，所述步骤1.2中扩增CD14CDS编码区反应总体系50μL：模板cDNA 0.5μL，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 26μL，灭菌蒸馏水21.5μL；

降落PCR扩增条件为：95℃预变性2min，94℃变性20s、58℃退火20s，72℃延伸3min；依次循环以上扩增条件；当从第2个循环开始，每个循环降落1℃，直至退火温度降到50℃，再按照95℃预变性2min，94℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸3min进行30个循环反应；最后，72℃后延伸15min。