[发明专利]一种大量冻存间充质干细胞的冻存液及方法

说明书

本发明公开了一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，包括：α‑MEM基础培养基，丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；丙二醇的浓度为1.2‑1.8mol/L，氮酮的浓度为0.5‑4.0ml/100ml；白蛋白的浓度为8‑12mg/ml，低分子右旋糖酐的浓度为7.5‑8.5ml/100ml。各组分以特定配比组合，形成的冻存液在大量冻存间充质干细胞时对细胞的损伤小，冻存细胞质量稳定，复苏时间短，存活率高。此外，本发明还提供了使用50ml冻存袋冻存间充质干细胞的方法，在保证细胞冻存质量的同时，极大缩短复苏所需时间，简化了复苏流程，进而降低复苏时间过长对间充质干细胞的影响。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，更具体的说是涉及一种大量冻存间充质干细胞的冻存液及方法。

背景技术

目前，间充质干细胞的临床转化应用越来越广泛，临床应用中对于间充质干细胞数量的要求也越来越高。但是现有的间充质干细胞均用1ml或1.5ml冻存管冻存，对于多个患者使用时，需要一次性复苏几十管，操作极为繁琐，浪费时间和人力，且影响细胞的存活率。

此外，现有技术中的冻存液大多添加二甲基亚砜(DMSO)，DMSO是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，从而降低冻存对细胞的损伤；然而，DMSO具有细胞毒性，深低温时，DMSO的细胞毒性受到抑制，但复苏时对细胞造成的毒性却非常严重，因此，要求操作人员复苏细胞时动作迅速，尽快洗掉二甲基亚砜；显然，对于大量复苏冻存管冻存的间充质干细胞而言，即使操作人员操作熟练，也容易影响细胞的存活率。

因此，如何提供一种复苏简单、快速，细胞存活率高的间充质干细胞冻存液及冻存方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种大量冻存间充质干细胞的冻存液及方法，一次性可冻存2.5×10⁸-3.5×10⁸个间充质干细胞，复苏简单快速，细胞存活率高。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，包括：α-MEM基础培养基，丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；所述丙二醇的浓度为1.2-1.8mol/L，所述氮酮的浓度为0.5-4ml/100ml；所述白蛋白的浓度为8-12mg/ml，所述低分子右旋糖酐的浓度为7.5-8.5ml/100ml。

其中，丙二醇为一种渗透性细胞冻存保护剂，毒性远低于DMSO，可减少冻存过程中渗透压的改变对细胞容积的影响，减少细胞内冰晶的形成，进而防止细胞形态崩解所造成的细胞冻存后死亡。

氮酮为一种无色至微黄色液体，无臭、无味、无毒。对亲油、亲水性活性成分均有明显的助渗作用，氮酮进入细胞内，与细胞内基质相作用，增强细胞膜的通透性，平衡细胞内外电解质的浓度，对冷冻细胞起到保护作用。

白蛋白为一种非渗透性细胞冻存保护剂，其分子量大，质量摩尔浓度低，可降低细胞外电解质浓度。

低分子右旋糖酐为一种非渗透性细胞冻存保护剂，可形成稳定的胶体溶液，保证冻存细胞质量的稳定性。

在大量冻存过程中上述冻存液成分相互配合既可缩短冻存时的相变时间，减少冰晶的产生，又可缩短复苏时的相变时间，避免产生再结晶导致细胞再次受到伤害。此外，本发明冻存液的共熔点温度低，利于间充质干细胞的大量冻存及快速复苏。并且，渗透性细胞冻存保护剂与非渗透性细胞冻存保护剂按特定比例相互协作，既减少了细胞内冰晶的形成，降低细胞外电解质浓度，又防止过度脱水所导致的细胞不可逆皱缩，进而避免复苏时极度膨胀所造成的细胞受损。

优选地，一种大量冻存间充质干细胞的冻存液，包括：α-MEM基础培养基，丙二醇，氮酮，白蛋白和低分子右旋糖酐；所述丙二醇的浓度为1.5mol/L，所述氮酮的浓度为2ml/100ml，所述白蛋白的浓度为10mg/ml，所述低分子右旋糖酐的浓度为8ml/100ml。