[发明专利]牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒及其方法在审
| 申请号： | 201810693144.8 | 申请日： | 2018-06-29 |
| 公开（公告）号： | CN108796106A | 公开（公告）日： | 2018-11-13 |
| 发明（设计）人： | 宫鹏涛;张西臣;高宇航;李显赫;任文陟;李建华;杨举 | 申请（专利权）人： | 吉林大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6893 | 分类号： | C12Q1/6893;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 | 代理人： | 陈宏伟 |
| 地址： | 130011 吉*** | 国省代码： | 吉林;22 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 琼脂糖凝胶电泳 安氏隐孢子虫 微小隐孢子虫 多重PCR检测 检测 十二指肠 隐孢子虫 试剂盒 退火 保守序列 大小差异 反应条件 技术支持 快速检测 扩增产物 目的片段 设计引物 特异性强 质量标准 寄生虫 常规PCR 三重PCR 基因 镜检法 灵敏度 灵敏性 实验用 扩增 粪便 样本 优化 | ||
1.用于扩增牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的nest-PCR扩增引物，具有以下序列：
十二指肠贾第虫PCR引物：
F1 ：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；
R1 ：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；
微小隐孢子虫PCR引物：
F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；
R2 ：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；
安氏隐孢子虫PCR引物：
F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；
R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；
所述的牛十二指肠贾第虫特异基因序列如SEQ No.1所示；
所述的微小隐孢子虫特异基因序列如SEQ No.4所示；
所述的安氏隐孢子虫特异基因序列如SEQ No.7所示。
2.一种牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒，其特征在于：
（1）配制牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的PCR反应液：2.5mM dNTPs、终浓度为10pmol/μL的上游引物和下游引物、10×PCR buffer，rTaq DNA聚合酶、DNA模板和ddH2O；
（2）如权利要求1所说牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫的三重PCR引物：
（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA模板为十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA，用于比较三重PCR产物以及监测三重PCR操作过程是否正确；
（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O；
（5）琼脂糖、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭10μg/μl，PCR 反应管。
3.如权利要求2所述的一种牛贾第虫、隐孢子虫多重PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1) 牛十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫三重PCR引物设计：
十二指肠贾第虫PCR引物：
F1 ：5'-CGACCTGACTATGACCAACTC-3'；
R1 ：5'-GTCCTGAAGCATCTCAACACT-3'；
微小隐孢子虫PCR引物：
F2：5'-CCTTACTCCTTCAGCACCTTATG-3'；
R2 ：5'-TGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA-3'；
安氏隐孢子虫PCR引物：
F3：5'-TACCGTGGCTATGACGGGTA-3'；
R3：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3'；
2)基因组DNA的提取：
提取牛粪便中的十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫基因组DNA；
3）在同一体系中对十二指肠贾第虫、微小隐孢子虫与安氏微小隐孢子虫进行PCR 扩增：
（1）准备待检样品的PCR反应管并分别标记，管内加入PCR反应液，然后加入引物、基因组DNA模板和rTaq Polymerase(5U/μl)，涡旋混匀后瞬时离心后，放入PCR仪中，设置PCR反应条件；
（2）PCR反应条件为：94℃预变性3min、94℃变性 30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共32个循环，后72℃延伸10min。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于吉林大学，未经吉林大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201810693144.8/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
