[发明专利]柑橘胼胝质合成酶基因家族的荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种柑橘胼胝质合成酶基因家族的荧光定量PCR检测试剂盒，包括12对荧光定量PCR检测引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:3～26所示。还公开了一种柑橘胼胝质合成酶基因家族的荧光定量PCR检测方法，提取待测样品的总RNA，采用前述的试剂盒进行荧光定量PCR检测。本申请提供的12对引物能够通过荧光定量PCR方法快速、准确检测出柑橘胼胝质合成酶基因家族中的柑橘胼胝质合成酶基因，检测灵敏度高，检测结果准确、可靠，为防治柑橘黄龙病等的进一步研究打下基础。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种柑橘胼胝质合成酶基因家族的荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

胼胝质是以β-1,3糖苷键结合的线性葡聚多糖，属于细胞壁的特殊组分或是与细胞壁结合的物质，在植物中并非普遍存在，仅占细胞壁总重的0.3％-5％。胼胝质在细胞分裂时会在细胞板积累，并可沉积在胞间连丝周围调控胞间运输能力，也可出现在韧皮部筛孔板孔处。筛孔是营养物质和信号分子长距离运输的主要通道，因此，胼胝质的合成、积累和降解受到严格的调控以保障整株植物中物质的运输。

胼胝质由胼胝质合成酶(callose synthase,CalS)以UDP-葡聚糖为底物催化合成。CalS是一种分子量较大的蛋白，具有多个跨膜结构域，含有3个保守的功能域Vta1、FKS1和glucan synthase。拟南芥中含有12个CalS基因，这些基因在细胞板的形成、调节胞间连丝空隙、花粉发育、筛孔及纤维形成、韧皮部运输、配子发育、气孔形成及抗生物学和非生物学逆境等过程中具有不同的调节功能。

柑橘黄龙病(HuangLongBing，HLB)是影响柑橘产业的一种非常严重的系统性侵染病害，被称为柑橘产业的“癌症”。该病主要由韧皮部专性寄生的难培养的革兰氏阴性菌(Candidatus Liberibacter Asianian,CLas)引起。感染黄龙病的柑橘出现叶片斑驳状黄化，果实部分着色,使得产量降低、品质劣变，甚至树体死亡。asaoka等(Y MasaokaAPustika，2014)和Marcos等(V MafraPK Martins，2013)的研究均发现，感染柑橘黄龙病后在筛板的筛孔中伴随有胼胝质和韧皮部蛋白沉积的现象，推测认为胼胝质的过度积累导致韧皮部堵塞，光合产物运输受阻，叶肉中淀粉过度积累，叶绿素被破坏，最终导致叶片出现失绿症状。进一步研究柑橘中胼胝质合成酶基因在柑橘中的表达情况和对黄龙病病原的应答机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题提供一种柑橘胼胝质合成酶基因家族的荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法。

实现该目的的技术方案是：

一种柑橘胼胝质合成酶基因家族的荧光定量PCR检测试剂盒，包括12对荧光定量PCR检测引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:3～26所示。

所述的检测试剂盒，还包括2×SYBRG荧光染料。

一种柑橘胼胝质合成酶基因家族的荧光定量PCR检测方法，提取待测样品的总RNA，利用上述试剂盒进行荧光定量PCR检测。

所述的荧光定量PCR检测的反应体系为12μL体系：4.4mL H₂O，0.3μL 10mM上、下游引物，6μL 2×SYBRG荧光染料，1μL cDNA。

荧光定量PCR反应条件为：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环。

本发明的有益效果是：本申请提供的12对引物能够通过荧光定量PCR方法快速、准确检测出柑橘胼胝质合成酶基因家族中的柑橘胼胝质合成酶基因，检测灵敏度高，检测结果准确、可靠，为防治柑橘黄龙病等的进一步研究打下基础。

附图说明

图1为CsCalS家族中功能域和跨膜区。

图2为柑橘与拟南芥中CalS基因编码氨基酸序列系统发育树。