[发明专利]一种7-羟基-4-甲基香豆素富集材料及其用途

说明书

本发明提供了一种7‑羟基‑4‑甲基香豆素富集材料，所述富集材料为采用以下方法制备：将琼脂糖与水混合后微波融化，搅拌均匀后冷却固化，得到琼脂糖凝胶；然后将苯硼酸溶液倒入琼脂糖凝胶的上方浸泡10min～24h，其中琼脂糖与苯硼酸的质量比为1:0.02～10，浸泡完毕后用去离子水洗涤，最后再对其用去离子水充分浸泡，即可制得7‑羟基‑4‑甲基香豆素富集材料。通过该材料在培养管底部的引入，当培养管中加入大肠杆菌和大肠埃希氏菌各自的显色/荧光底物培养基培养时，可以实现一根培养管同时测定大肠杆菌和大肠埃希氏菌。

技术领域

本发明提供了一种7-羟基-4-甲基香豆素富集材料，该材料用于同时测定大肠杆菌和大肠埃希氏菌中，属于微生物检测技术领域。

背景技术

大肠菌群是衡量食品卫生状况、尤其是存在肠道致病菌潜在威胁的重要指标，因而也是几乎任何食品都必须检测的重要微生物项目。传统的检测方法基于发酵乳糖，产酸和产气，培养时间24-96h。但是由于大肠杆菌厌氧株的发现(Appl EnvironMicrobiol.1982 43(6):1320–1329.)，以产气作为鉴定依据在某种程度上就失去了意义。

大肠菌群测试更多采用测定β-半乳糖苷酶的方法来替代乳糖发酵试验，通过培养温度控制为44.5℃来抑制非肠道来源的其它具有β-半乳糖苷酶的格兰氏阴性菌生长。测定β-半乳糖苷酶常用的底物有7-羟基-4-甲基香豆素-β-D-半乳糖苷(MUGal)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、邻硝基酚-β半乳糖苷(ONPG)等。当这些试剂中的半乳糖苷被大肠菌群产生的半乳糖苷酶水解后，产生荧光或颜色产物，从而实现大肠菌群的快速鉴别。大肠埃希氏杆菌同样作为卫生学指标来指示环境及样品是否有粪便污染。7-羟基-4-甲基香豆素葡糖苷酸(MUG)培养基用于大肠埃希氏杆菌快速检测。(GB/T 4789.32-2002,GB/T5750.12-2006)。细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于7-羟基-4-甲基香豆素-β-D葡萄糖醛酸苷(4-Methylumbellifery-β-D-Glucuronide简称MUG)的β-葡糖醛酸苷键，使其水解，释放的7-羟基-4-甲基香豆素在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。97％的大肠埃希氏杆菌、10％的沙门氏菌以及少量的志贺氏菌具有葡萄糖醛酸苷酶。1995年该方法被美国国家环境保护署采纳(Code of Federal Regulations 40,141.21Protection ofEnvironment)。有关大肠菌群具有β-半乳糖苷酶的特性，ISO 9308-1:2000已给予了明确的定义。近年来，大肠杆菌和大肠埃希氏菌的检测主要通过含有上述底物的平板显色检测，如：法国生物梅里埃公司、法国科马嘉公司、英国OXOID公司、北京陆桥技术有限责任公司、青岛海博生物技术有限公司及广东环凯生物技术有限公司等的相关产品。酶底物平板法自动化程度不高，阳性菌落计数繁琐且易因稀释不精确而出现计数误差。

美国IDEXX公司开发了一种基于计数盘的大肠杆菌和大肠埃希氏菌同时检测方法。水样与含两种显色/荧光底物的培养基粉末混合，倒入分为若干区室的定量盘内，密封培养。当稀释浓度合适，每个区室只有1个菌或0个菌。结果可以很方便跟MPN方法关联，使用该方法24小时以内可以实现大肠埃希氏菌和总大肠杆菌的快速检测。然而，上述方法对稀释度要求较高，当稀释不合理时，容易出现全板阳性或全板阴性无法计数，肠杆菌科一般生长较快，24小时实现定量时间还是显得略长，不能完全满足饮用水检测及环保执法的要求。鉴于上述需求，美国Neogen公司开发了Biolumix实时微生物荧光光电快速检测系统，通过溶液培养实时监测荧光及颜色变化，实现了大肠杆菌、大肠埃希氏菌及其他微生物无需稀释10小时内快速检测。快速培养-显色/荧光的方法无需样品稀释，容易做成在线自动化仪器，培养时间短，在环保领域具有较大的优势。然而水体卫生学指示菌检测通常总大肠杆菌及大肠埃希氏菌指标都需要检测，实际检测时需要两次培养测定。如两个检测的荧光/颜色底物同时加入一个培养管，颜色产物通常是较好的荧光淬灭剂会淬灭可能的荧光产生，不利于荧光结果的判读。

发明内容