[发明专利]一种重组大肠杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种重组大肠杆菌及其应用，所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示的来源于长双歧杆菌IEF101的L‑抗坏血酸糖基化酶基因转入大肠杆菌宿主细胞获得的。本发明采用生物法一步催化转化高效生产单一糖基化产品AA‑2G；本发明重组大肠杆菌E.coli IEF‑blsp101能够在胞内高效合成蔗糖磷酸化酶，并以L‑抗坏血酸和蔗糖为底物，高效催化L‑抗坏血酸的糖基化反应，45‑72h内催化得到90‑100g/L的AA‑2G，平均生产强度大于1.3g·L^‑1·h^‑1。

(一)技术领域

本发明涉及一种含L-抗坏血酸糖基化酶基因的重组大肠杆菌及其生产2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的应用。

(二)技术背景

L-抗坏血酸(VC)是一种常见的水溶性维生素和人体所必须的营养元素，其结构如图1所示。缺乏VC会引起坏血病，心脏病，癌症等疾病，由于人体无法合成VC，因此必须从食物中获取。此外，也可作为调味剂，还原剂，抗氧化剂，漂白剂等，广泛应用于食品，化妆品和医药等领域。但是VC本身不稳定，其分子中2位和3位碳原子上的烯醇式羟基极易被氧化解离，使VC丧失还原活性，从而限制了其应用。

L-抗坏血酸衍生物主要有金属盐，酯类衍生物，葡萄糖衍生物，其中2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)因其具有强稳定性，高安全性而备受关注。AA-2G进入体内后能被α-葡萄糖苷酶分解为VC和D-葡萄糖，使VC可以在体内保持有活性的烯醇式结构，是VC的最佳替代品，目前广泛应用于化妆品、食品、医疗保健及畜牧业个水产养殖等行业。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种含有L-抗坏血酸糖基化酶基因的大肠杆菌及制备2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的应用，实现生物法一步催化转化，高效生产AA-2G。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将SEQ ID NO.1所示来源于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)IEF101的L-抗坏血酸糖基化酶基因(GenBank登入号：MH473732)转入大肠杆菌宿主细胞获得的。

进一步，所述L-抗坏血酸糖基化酶基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

进一步，所述重组大肠杆菌按如下方法构建：将SEQ ID NO.1所示的L-抗坏血酸糖基化酶基因克隆到pET28a质粒上，构建pET28a-blsp重组表达质粒，并转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-blsp)。

第二方面，本发明提供一种所述重组大肠杆菌在制备AA-2G中的应用，具体所述的应用以重组大肠杆菌经发酵培养获得的发酵液、发酵液离心后的湿菌体与缓冲液或去离子水的菌悬液或菌悬液破碎液为催化剂，以L-抗坏血酸为底物，以蔗糖为辅助底物构成反应体系，在30-45℃(优选35-40℃)、pH为4.8-5.5的条件下进行反应，获得含AA-2G的反应液，分离纯化获得AA-2G。所述反应体系中，催化剂用量以湿菌体重量计，所述湿菌体含量为5-100g/L(优选5-10g/L)，底物终浓度为50-250g/L(优选100-250g/L)，所述蔗糖终浓度为200-400g/L(优选250-300g/L)。

进一步，所述催化剂为发酵液离心后的湿菌体用缓冲液或去离子水的菌悬液破碎后的破碎液，所述催化剂用量以破碎前湿菌体用量计，所述底物以一次投料法加入反应液中。

进一步，所述缓冲液为pH5.2，50mM柠檬酸钠缓冲液。

进一步，反应液的温度控制30-45℃(优选35-40℃)，反应过程控制pH4.8-5.5之间，反应48-72h。