[发明专利]检测ATP7B基因突变的检测体系及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测ATP7B基因突变的检测体系及其试剂盒，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333 G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，用于检测第13号外显子c.2975 C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针B；所述肽核酸探针A的核苷酸序列与ATP7B基因c.2333突变型位点完全互补，所述肽核酸探针B的核苷酸序列与ATP7B基因c.2975突变型位点完全互补；所述肽核酸探针的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团。本发明的检测ATP7B基因突变的检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PCR定量检测。

技术领域

本发明涉及一种检测ATP7B基因突变的检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

Wilson病(WD)，亦称肝豆状病变，是一种与铜代谢障碍相关的常染色体隐性遗传病。WD起病时通常有一段无症状期，期间铜在肝脏中积累，从而导致亚临床肝炎和神经精神症状的发展。ATP7B基因是目前唯一已知的WD相关基因，ATP7B基因全长约80kb，含22个外显子。ATP7B是一个膜相关的金属转运ATP酶，能利用ATP提供的能量使天冬氨酸残基磷酸化的同时实现铜离子转运，参与铜跨膜转运过程。其生理功能是使铜离子活化、使金属铜结合到铜蓝蛋白中，维持正常铜代谢。当前已报道的ATP7B基因突变已有500余种。对我国WD患者的研究表明，发生在8、12、13和16外显子的基因突变占70％以上。其中8号外显子Arg778Leu突变频率高达46.15％，证实了在我国Arg778Leu是基因突变热点，而13号外显子Pro992Leu突变占15.38％，突变频率位居第二。

外周血细胞游离DNA是来自正常细胞和肿瘤细胞死亡后释放的核酸片段总称。由于其再体内的半衰期较短且细胞释放的核酸会进入外周血，因此cfDNA较之于组织标本更能实时全面地反映患者体内的肿瘤情况。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。多重数字PCR由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。与常规的ARMs方法相比，多重数字PCR在检测血浆cfDNA时灵敏度明显优于ARMs法。

PNA(peptide nucleic acid)中文名称肽核酸，是一种全新的人工合成DNA类似物，它与DNA分子的差异在于戊糖磷酸二酯键骨架被中性肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代，其他结构与DNA一致。基于PNA的多重数字PCR技术主要依赖PNA探针的两个重要特性：第一，PNA只能与完全配对的互补DNA链杂交，只要有单一碱基发生错配，PNA就不能与互补的DNA链结合；第二，PNA寡聚体不能被DNA聚合酶识别，从而不会成为PCR扩增的引物。相反，它作为特定序列选择工具，可以阻止想应的PCR扩增。一旦模板中的目的基因发生突变并因此出现错配，DNA/PNA双链结合松动，DNA寡聚体模板链就可以正常延伸，作为PCR引物，使发生突变的样本在多重数字PCR中得到阳性扩增产物，而野生型基因则不会扩增。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种包含由强螯合基团修饰的肽核酸探针，灵敏度和特异性高，模板DNA需求量少，可以快速便捷地进行精准定量PCR检测的ATP7B基因突变检测检测体系及其试剂盒。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测ATP7B基因突变的检测体系，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；

所述引物探针混合液包括用于检测第8号外显子c.2333G>T位点的上下游引物A和肽核酸探针A，以及用于检测第13号外显子c.2975C>T位点的上下游引物B和肽核酸探针B；