[发明专利]大肠杆菌基因工程菌的构建及其生产L-色氨酸的用途

说明书

本发明涉及一株大肠杆菌基因工程菌及利用其快速高效生产L‑色氨酸的方法。所述基因工程菌是通过代谢工程的方法(包括基因整合和点突变与启动子替换)对大肠杆菌中L‑色氨酸合成相关基因进行对应改造组合，又在其基因组上引入来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶编码基因glnA后得到的。利用该菌株进行摇瓶发酵可在24h内积累L‑色氨酸达10‑12g/L，为目前国内报导的最高值；该菌株在5L发酵罐发酵35‑40h可积累L‑色氨酸达40‑45g/L，相比现有携带质粒的L‑色氨酸工业化菌株提高了15.1％，说明该菌株具有良好的工业化生产L‑色氨酸的潜力。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，以及利用该工程菌快速高效生产L-色氨酸的方法，属于微生物代谢调控和基因工程技术领域。

背景技术

L-色氨酸，是一种必需氨基酸，已经被广泛地用作饲料添加剂、药品比如输液剂和保健功能食品等的基础原料。其生产方法包括化学合成法、酶反应法、发酵法等，但目前主要使用利用微生物的直接发酵法，该方法以葡萄糖等低价原料为底物通过发酵生产L-色氨酸，生产成本较低，生产工艺相对简单可控。

由于L-色氨酸的合成代谢途径长而复杂，所涉及的前体物较多，在野生型的大肠杆菌中积累L-色氨酸的水平极低。最初的研究主要通过诱变育种的方式构建L-色氨酸生产菌株，随后通过对诱变所得菌株进行一些关键酶基因的测序，得到许多解除了反馈抑制的关键酶基因序列。结合基因工程手段，将所得到的解除反馈抑制的关键酶基因进行过表达以强化L-色氨酸的合成途径，是构建大肠杆菌L-色氨酸工程菌株的主要研究方向。

其主要基因工程手段中，发挥关键作用的关键酶基因的过表达方式一般选择通过构建过表达质粒方式进行，其质粒大多都具有强启动子、高拷贝数等特征。该过表达方式虽然可以达到强化L-色氨酸合成途径的目的，但所构建工程菌株也存在携带抗性、需要添加诱导剂、给菌体生长带来负担等不利影响。Chen L和Zeng AP(Applied Microbiology&Biotechnology.2017.101(2):559)通过基因整合的方法构建了不携带质粒的大肠杆菌L-色氨酸工程菌，分析了其发酵过程中的胞内外中间产物及前体物变化，文中提到在发酵后期胞内L-谷氨酰胺含量较低，其作为合成L-色氨酸的前体物可直接影响发酵生产L-色氨酸的产量及转化率。

大肠杆菌细胞内L-谷氨酰胺的再生是通过谷氨酰胺合成酶催化L-谷氨酸和铵盐反应来完成的。然而，谷氨酰胺合成酶会发生腺苷酰化现象，导致其酶活急剧降低。在铵盐超过需求量时，腺苷酰化程度加强，谷氨酰胺合成酶活性下降甚至失活，但L-谷氨酰胺的生成又不可缺少铵盐供应。此外，在氨基酸、有机酸等发酵过程中，由于胞内产物积累导致pH下降，此时常规微生物谷氨酰胺合成酶的酶活较低。因此，寻求高活性谷氨酰胺合成酶来强化细胞内L-谷氨酰胺的再生，在生物合成L-色氨酸等产品中具有重要的应用价值。

目前，国内用于生产L-色氨酸的大肠杆菌大多是携带质粒的菌株，发酵过程中质粒易丢失，加上L-色氨酸合成途径涉及到的前体物较多、发酵后期易积累较多副产物等因素的影响，现有的L-色氨酸大肠杆菌工程菌株的发酵工艺存在控制困难、产量与糖酸转化率较低、提取工艺复杂等问题。

发明内容

针对上述存在问题，本发明目的是通过代谢工程和基因工程的方法构建能够高效生产L-色氨酸的大肠杆菌基因工程菌，从而实现L-色氨酸的安全、快速、高效生产。所述基因工程菌是通过代谢工程的方法(包括基因整合和点突变与启动子替换)，对大肠杆菌的L-色氨酸合成途径中相关基因进行组合改造而得到的。大肠杆菌中与L-色氨酸合成相关的基因包括aroG(3-脱氧-σ-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶编码基因)、serA(3-磷酸甘油酸脱氢酶编码基因)、trpEDCBA(色氨酸操纵子编码基因)。

在本发明中采用如下定义：

1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法