[发明专利]一种利用TRPV1启动子及光遗传学手段特异性抑制疼痛生成与传递的方法

说明书

本发明涉及到一种利用TRPV1启动子及光遗传学手段在特异性地抑制体内疼痛神经元兴奋进而抑制疼痛生成与传递的方法，是一种新的非侵入性、特异性缓解疼痛的方法。用TRPV1启动子驱动光抑制性敏感蛋白ArchT特异性的表达在动物DRG的中小型神经元即伤害性感受器中，当给予532nm的绿色激光刺激时，ArchT蛋白会将神经细胞中的H+泵到细胞外使细胞超极化而被抑制，从而达到抑制疼痛的效果。这是一种全新的、非侵入性的、特异性的抑制疼痛的方法。该研究势必会为以后镇痛的基因治疗奠定良好的理论与实践基础。

技术领域

本发明涉及到一种利用TRPV1启动子及光遗传学手段在特异性地抑制体内疼痛神经元兴奋进而抑制疼痛生成与传递的方法。广泛地应用于生物学、光遗传学、神经科学领域，具体地涉及用TRPV1启动子、光抑制性敏感蛋白ArchT和AAV5构建了一种重组AAV病毒(AAV5-TRPV1-ArchT-eGFP)，将其直接注射到动物的DRG中，待目的蛋白ArchT高量并稳定表达在神经元细胞膜后研究其对神经系统及动物疼痛反应的抑制作用

背景技术

慢性疼痛是一种病理性状态，大大降低人们的生活质量。然而迄今为止，仍然没有特异性治疗慢性疼痛的方法。目前可使用的镇痛药物既缺乏针对性同时又具有严重的副作用。因此建立一种非侵入性、特异性抑制疼痛的方法就变得非常重要。

近年来研究发现，因为疼痛就医的病人占病人总量的40%以上，其中又有20%的疼痛病人遭受着超过六个月以上的慢性疼痛的折磨。慢性疼痛给病人带来极大的痛苦，大大降低人们的生活质量。很多病人因为慢性疼痛的折磨无法正常睡眠与工作，更严重的会导致由慢性疼痛转变为部分或者完全残疾。然而目前对于疼痛的治疗主要是通过药物、外科手术、电刺激和躯体康复治疗等技术手段。通过外科手术的方法治疗疼痛，除了给病人带来比较大的外部创伤外，伤口也比较难恢复，同时手术费用昂贵。电刺激、针灸、推拿等物理疗法也有很大的弊端，如镇痛效果不显著、治疗周期长等。而临床上最常用的方法则是药物治疗。阿片类受体激动剂吗啡、谷氨酸受体拮抗剂NS1209和氯胺酮、Na+通道阻断剂美西律和拉莫三嗪、K+通道开放剂瑞替加滨和氟吡汀以及GABA调节剂安定等常常作为镇痛药物使用。这些药物既缺乏针对性同时又具有严重的副作用。例如吗啡的使用可造成剂量依赖性的增加，临床表现为药物成瘾，使患者承受很大的痛苦。

目前光遗传学 (optogenetics)在神经科学领域应用十分广泛。所谓光遗传学是指，把光学与遗传学的手段结合起来，用以激活或者失活特定组织及细胞的学问与技术。到目前为止已有大量光遗传学蛋白被表达并应用在不同生物的神经系统，其中抑制性光敏感蛋白有：Halorhodopsin (NpHR) 、Archaerhodopsin-3和ArchT等。近年来研究表明相比于NpHR，Arch可以快速恢复由光诱导的失活状态，降低光敏感蛋白对光的不应期。ArchT不仅具有Arch同样的功能，且光敏感性比Arch高三倍以上。ArchT可以稳定并高量的表达在神经细胞膜上，同时也可以很好的表达在神经突起上。体外光照情况下ArchT可以介导产生最大约900pA的光电流使细胞膜超级化，从而介导对神经系统的抑制作用。

光遗传学的主要方法是利用不同类型的病毒载体，把光敏感蛋白引入离体或在体动物神经系统中。然后根据不同的光敏感蛋白使用不同波长的光照射，激活该光敏感蛋白使其发挥作用达到激活或者失活特定神经细胞的目的。目前由于腺相关病毒（AAV）具有自然缺陷、安全性好、无致病源性、宿主细胞范围广、在体内表达外源基因时间长等特点，被广泛应用与这种病毒载体，携带光敏感蛋白进入并表达在宿主神经细胞中。AAV有十几种血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10等。研究表明直接DRG注射的情况下AAV5具有最高的感染效率。