[发明专利]一种β-甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表达水平的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种β‑甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表达水平的方法。本发明为提高耐热酸性β‑甘露聚糖酶Man5AS11R在毕赤酵母工程菌中的诱导表达量，首先应用Gene Designer(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)软件对man5AS11R基因的核苷酸序列进行密码子偏向性优化，通过pPIC9k‑man5AS11R‑opt重组载体，成功构建了毕赤酵母工程菌GS115/man5AS11R‑opt。在此基础上，通过重组载体pPICZ‑αA‑vgb在菌株GS115/man5AS11R‑opt中完成了血红蛋白VHb的共表达，显著促进了毕赤酵母工程菌发酵过程中的溶氧水平，提高了该工程菌发酵密度和产量，10L发酵罐发酵产酶达到20000U/mL以上，较原始菌株GS115/man5AS11R产量提高了一倍，显示了良好的产业化生产前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种β-甘露聚糖酶密码子优化序列及提高毕赤酵母工程菌表达水平的方法。

背景技术

近年来随着对自然界半纤维素资源的开发、利用，饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露低聚糖药用价值的发现，使得对β-甘露聚糖酶的需求量越来越大。目前，市场上β-甘露聚糖酶商品酶制剂有美国chengem公司生产的和美酵素，还有国内博士奥集团生产的华分酶及挑战集团的β-甘露聚糖酶等，但因为产量小，产品的相对价格很高，大大降低了该酶的应用范围。

毕赤酵母表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，工业上常用来大规模表达外源蛋白。但对于一些来源于细菌的基因，其表达水平往往偏低，即使经过密码子优化，而不一定能够达到理想的表达水平。另外，毕赤酵母的高密度发酵也是实现外源蛋白高水平表达的关键，而毕赤酵母在高密度发酵时需要消耗大量氧气，溶氧的水平常常直接影响异源蛋白的表达水平。因此，应用透明颤菌的血红蛋白 （Vitreoscialla hemoglobin,VHb）作为一种氧调节蛋白，理论上可以结合游离氧，从而使发酵液中的氧含量提高，改善细胞生长条件，促进细胞总蛋白的合成和外源蛋白的积聚。

发明内容

1.本发明的目的在于提供一种提高耐热酸性β-甘露聚糖酶Man5AS11R在毕赤酵母工程菌中表达水平的方法，其具体步骤如下：

（1）对man5AS11R基因的核酸序列进行针对毕赤酵母菌的密码子优化，得到优化后的编码序列man5AS11R-opt，如SEQ ID NO.1所示：

ACTGGTTTCTACGTTAACGGTGGTAAGTTGTACGACTCTACTGGTTGTCC 50

ATTCTACATCGTTGGTATCAACCACGGTCACTCTTGGTTCAAGAACGACA 100

CTGCTACTGCTATCCCAGCTATCGCTAAGACTGGTGCTAACACTGTTAGA 150

ATCGTTTTGTCTAACGGTACTCAATACACTAAGGACGACTTGAACTCTGT 200

TAAGAACATCATCAACTTGGCTGAAGAAAACAAGATCGACGCTGTTTTGG 250

AAGTTCACGACGCTACTGGTAAGGACGACTTCAACTCTTTGGACGCTGCT 300

GTTAACTACTGGATCTCTATCAAGGAAGCTTTGATCGGTAAGGAAGACAG 350

AGTTATCGTTAACATCGCTAACGAATGGTACGGTACTTGGAACGGTTCTG 400

CTTGGGCTGACGGTTACAAGAAGGCTATCCCAAAGTTGAGAGACGCTGGT 450