[发明专利]急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型及其microRNA筛选方法和应用

权利要求书

1.一种急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型的建立方法，其特征在于，包括步骤如下：采用多次高糖注射诱发大鼠急性高糖血症，联合线栓法闭塞大脑中动脉5小时后再通19小时的方法，建立急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型。

2.根据权利要求1所述的急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型的建立方法，其特征在于，具体步骤如下：

A)选取大鼠，麻醉，在插线闭塞大脑中动脉前15分钟，腹腔注射葡萄糖溶液，诱发急性高血糖症；

B)在颈部中线旁左侧0.5cm行旁正中切口，分离颈前浅、深筋膜、胸锁乳突肌和二腹肌；暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)及其远端分支翼腭动脉；

C)在ECA远端备2根5-0丝线，结扎并剪断ECA，牵引ECA残端使其与CCA保持方向平行；ICA远端和CCA近端放置动脉夹，阻断血流并保持ECA残端充盈；ICA近端及ECA残端各备一根线并打结，但未收紧；

D)然后在ECA残端剪一小口，取头端为光滑球形的尼龙线栓，由左侧ECA残端逆行经ICA插入左侧大脑中动脉(MCA)，线栓进入距离CCA分叉处约18-20mm并遇到阻力时停止进一步插线，收紧ICA和ECA处的备线，固定尼龙线栓，达到闭塞一侧MCA主干，缝合切口并将线栓埋在皮下；

E)在闭塞后1h、2h、3h和4h分别腹腔注射葡萄糖溶液以维持大鼠呈高血糖状态；

F)持续闭塞MCA主干形成缺血5h后，撤出丝线模拟机械再通恢复脑血流量；

G)再通恢复脑血流量19h后，完成模型的建立。

3.一种权利要求1～2任一所述方法建立的急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中大脑组织microRNA的筛选方法，其特征在于，具体过程如下：

1)选取急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中大脑组织；

2)Trizol法提取脑组织中RNA，纯化；

3)测量RNA浓度，电泳检测RNA完整性后，荧光标记；

4)荧光标记的样本与microRNA芯片进行反应，清洗，检测得到显著差异表达的microRNAs；

5)采用荧光定量qRT-PCR技术对步骤4)所得结果进行验证，从而筛选得到表达存在显著性差异的microRNAs。

4.根据权利要求3所述的急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中大脑组织microRNA的筛选方法，其特征在于，所述步骤5)中验证的方法如下：

i)选取完整的RNA进行cDNA合成；

ii)对步骤i)所得cDNA进行荧光定量PCR。

5.根据权利要求4所述的急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中大脑组织microRNA的筛选方法，其特征在于，所述cDNA合成过程如下：PCR管中加入RNA和引物混合物，加无RNA酶的水使总体积至13ul，65℃保温5分钟后迅速在冰上冷却2分钟；离心后，加入12μlRNA/引物变性溶液、0.5μl 10mM dNTP混合液、0.25μl RNase抑制剂、4μl 5×M-MLV缓冲液、0.5μl RTase M-MLV，并用无RNA酶的双蒸水稀释至20μl；37℃保温1分钟。

6.根据权利要求5所述的急性脑缺血机械再通后颅内出血转化模型中大脑组织microRNA的筛选方法，其特征在于，所述荧光定量PCR过程如下：

①构建cDNA反应体系：2×Master Mix 5μl、10uM PCR特异引物F 0.5μl、10uM PCR特异引物R 0.5μl和cDNA2μl，加水至总体积为10μl；手指轻弹管底使溶液混匀，5000rpm短暂离心；混合液待用；

②PCR反应：将8ul混合液滴加到384孔PCR板中；再加入对应的2μl cDNA；然后粘上密封薄膜封口膜，短暂离心混匀；在PCR程序进行设置前将准备好的PCR板置在冰上；将上述384孔PCR板置于Realtime PCR仪器上进行PCR反应。