[发明专利]一种CIK细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种CIK细胞及其制备方法和应用，属于生物技术领域。采用的技术方案为：对外周血单个核细胞先用IL‑7进行预刺激，然后用低浓度的anti‑CD3和anti‑CD28进行刺激，最后加入anti‑CD95进行刺激，制得CIK细胞。与现有技术相比，本发明加入的细胞因子/抗体的种类和工作浓度均低于其它方法，节约成本。而且本发明方法在体外抗肿瘤实验中的肿瘤杀伤作用明显高于现有的方法，并且在体外培养中不需换液，操作简单，但仍维持比其它方法更好的细胞活性。本发明在控制和缓解恶性肿瘤或其它疾病的进展方面具有广阔的前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CIK细胞及其制备方法和应用。

背景技术

CIK(Cytokine-induced killer cells，细胞因子诱导的杀伤细胞)是T细胞和NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)混合的细胞群。CIK一般是人PBMC(peripheralblood mononuclear cells，外周血单个核细胞)体外在IFN-γ(interferon-gamma)，抗CD3抗体(anti-CD3)，抗CD28抗体(anti-CD28)，白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-2(IL-2)等细胞因子/抗体诱导培养制备的。在T淋巴细胞不能识别缺乏MHC标记的恶性细胞时，CIK细胞能够介导MHC限制性和非限制性的抗肿瘤细胞毒性作用，从而介导更迅速的免疫应答。这些特征使得CIK细胞在肿瘤免疫治疗中很有应用前景。

然而CIK细胞的培养过程需要多种细胞因子和抗体，成本较高。培养时间也比较长，中间换液操作也较多，易发生污染等情况。另外，受激活诱导的细胞凋亡机制影响，CIK细胞的活性维持时间有很大限制，局限了其在体内的发挥效应的时间。因此CIK细胞制备技术还有待改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CIK细胞及其制备方法和应用，该方法操作简单、添加细胞因子/抗体种类少，且培养过程中无需换液；经该方法制得的CIK细胞的肿瘤杀伤作用力强。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的CIK细胞的制备方法，对外周血单个核细胞先用IL-7进行预刺激，然后用低浓度的anti-CD3和anti-CD28进行联合刺激，最后加入anti-CD95进行刺激，制得CIK细胞。

优选地，对外周血单个核细胞先用25ng/mL的IL-7预刺激48h。

优选地，低浓度的anti-CD3和anti-CD28指1μg/mL的anti-CD3和anti-CD28。

优选地，同时添加anti-CD3和anti-CD28刺激48h。

优选地，加入1μg/mL的anti-CD95刺激4d。

优选地，分离制备外周血单个核细胞具体操作为：用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，并将外周血单个核细胞培养于含10％胎牛血清、100units/ml青霉素和100μg/ml链霉素的GT-T551培养基(TAKARA公司)中，备用。

本发明还公开了基于上述的制备方法制得的CIK细胞。

本发明还公开了CIK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述CIK细胞诱导Th1免疫细胞，参与体外抗肿瘤免疫反应。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的CIK细胞的制备方法，首先分离人外周血单个核细胞，经IL-7预刺激，然后应用低浓度的anti-CD3以及anti-CD28亚激活细胞，亚激活细胞再加入anti-CD95刺激，最终制得CIK细胞。该方法的优势体现在：