[发明专利]重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法

说明书

本发明公开了重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET‑21b‑SUMO蛋白酶表达质粒的构建；S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析、Superdex 200凝胶过滤层析等方法对目标蛋白酶进行提纯，大幅缩短了目标蛋白酶的纯化流程与纯化时间，同时提高了蛋白酶的纯度、得率和酶活，节省实验步骤并减少成本。本发明方法，为研发及生产其他蛋白类工具酶奠定了基础。

技术领域

本发明涉及聚合物反应领域，具体为重组SUMO蛋白酶在大肠 杆菌中的生产方法。

技术背景

目前，蛋白产量及活性不高是异源蛋白表达尤其是毒性蛋白表达 的技术瓶颈。随着生物技术的发展，研究者应用融合表达策略克服毒 性及难溶性蛋白的表达难关。

自2004年以来，SUMO作为融合标签越来越多地用于表达系统 中。SUMO比传统的融合标签如硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、麦芽 糖结合蛋白等具有更大的优势，除了具有传统融合标签的促进可溶性 的特性外，还具有分子伴侣功能，能促进目的蛋白的正确折叠等特点， 同时对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋白的稳定性。

SUMO融合标签的更大的优势在于其具有与其配套的SUMO 蛋白酶。SUMO蛋白酶具有较强的专一性，它所识别的区域并非其 他丝氨酸蛋白酶或化学试剂的一级序列，而是蛋白质的三维结构，因 此导致其切割效率高而且不具有非特异性。SUMO蛋白酶识别 SUMO三级结构后，能从SUMO末端的双甘氨酸处将目的蛋白从融 合蛋白上切割下来，不存在任何氨基酸残留，因而较适用于表达天然 序列的重组蛋白。

SUMO蛋白酶能特应性地切割含SUMO位点的融合蛋白，SUMO 蛋白酶切位点常被用于客户融合蛋白标签的切除，高纯度和高活性的 SUMO蛋白酶的研制成功将产生一定的商业价值。

目前，市场上SUMO蛋白酶，生物活性普遍较低，而且常见的 SUMO蛋白酶生产方法，步骤繁琐，成本较高。因此，研发一种重组 SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，实现高纯度重组SUMO蛋 白酶的制备，从而节省实验步骤并减少成本，是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于：提供重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生 产方法，以解决上述技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：

S1、PET-21b-SUMO蛋白酶表达质粒的构建；

S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；

S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。

优选地，所述的步骤S1，具体分如下步骤：

a、根据密码子优化后的基因序列，SUMO蛋白酶直接进行基因 合成；

b、将PET-21b载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基 因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；

c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置 30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ul LB液 体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL 氨苄青霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；

d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含 氨苄青霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过 夜，抽提质粒并Sanger法测序。

优选地，所述的步骤S2，具体分如下步骤：