[发明专利]一种构建高效分泌表达细菌肝素水解酶重组菌的方法

权利要求书

1.一种表达细菌肝素水解酶重组菌，其特征在在于，所述重组菌是以毕赤酵母Pichiapastoris GS115为宿主，表达来源于Burkholderia pseudomallei的肝素水解酶。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在在于，所述肝素水解酶的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在在于，所述肝素水解酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在在于，所述的重组菌的构建方法是：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的肝素水解酶基因连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，筛选正确的转化子，即得重组毕赤酵母Pichia pastorisGS115/pPIC9K-BpHEP。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在在于，所述重组菌的构建方法在肝素水解酶基因上添加组氨酸标签。

6.一种发酵生产肝素水解酶的方法，其特征在在于，所述方法是利用权利要求1-5任一所述的重组菌进行发酵生产。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是在发酵罐中采用甲醇诱导策略发酵生产肝素水解酶。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵方法具体步骤为：

将摇瓶培养的YPD种子液以10％的接种量接种于3L全自动发酵罐(LiFlus GMBioTRON,Korea)中，温度控制在25-30℃，使用25％氨水调节pH为5-6，初始搅拌转速为500-1000r·min^-1，通气量为2-4L·min^-1，溶氧维持在30％-35％以上。培养大约20-40h，OD₆₀₀约70-80待甘油耗尽，指数流加30-50％(W·V^-1)甘油溶液(含12mL·L^-1PTM1)，搅拌转速与溶氧相关联，控制转速在500-1000r·min^-1补料12h，停止补料待甘油再次耗尽，OD₆₀₀约250(干重约60.0g·L^-1)，转速在600-1000r·min^-1并流加100％甲醇(含12mL·L^-1PTM1)，甲醇浓度控制在18.0g·L^-1，诱导温度分别采用30℃，25℃，22℃及阶段控制温度诱导策略。本发明的第四个目的是提供一种所述肝素水解酶分离纯化的方法，具体步骤如下：离心发酵液，收集上清液，上样；使用Ni柱，用磷酸盐缓冲液平衡柱子10柱体积；采用咪唑梯度洗脱，咪唑用上述磷酸缓冲液配制，按照10mmol·L^-1，30mmol·L^-1，200mmol·L^-1梯度洗脱。