[发明专利]一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法

权利要求书

1.一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60-80%的乙醇消毒30-35s，然后用0.1%HgCl₂ 溶液消毒5-10min，再用无菌水冲洗5-8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2-5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的木贼愈伤组织；

B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45-70% MS培养基、10-25%卡拉胶、2.5-5.5% 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-4.2%蔗糖、0.05-0.2% 3-吲哚丁酸、0.05-0.35% N6-异戊烯基腺嘌呤、0.04-0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；

C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100-120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000-1500lx，每天光照8小时，培养10-12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末；

D、 按质量比1:（1-3）将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2-3）混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量阿魏酸木贼提取物。

2.根据权利要求1所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20-25g/L、琼脂3-6g/L、噻苯隆1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.01-0.07mg/L，pH值5.8。

3.根据权利要求1所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养20-30天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。

4.根据权利要求1所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养40-60天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。

5.根据权利要求1-4任一项所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于：所得高含量阿魏酸木贼提取物可以添加至化妆品，使得化妆品具有美白和保湿功效。

6.根据权利要求5所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述化妆品为眼霜。

7.根据权利要求6所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述眼霜包括如下重量百分比的组分：权利要求1-4任一项制得的阿魏酸木贼提取物0.1-5%、霍霍巴（SIMMONDSIA CHINENSIS）脂0.1-2%、环五聚二甲基硅氧烷5-15%、环己硅氧烷1-5%、聚二甲基硅氧烷1-5%、聚二甲基硅氧烷醇1-3%、SEPIPLUS 265 0.3-0.8%、聚二甲基硅氧烷 PEG-10/15 交联聚合物0.1-2%、丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1-0.5%、水解透明质酸钠0.01-0.1%、精氨酸0.1-0.5%、焦糖色0.001-0.01%、多元醇5-15%、水余量。