[发明专利]一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶活性的方法

权利要求书

1.一种测定人外周血中次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)酶活性的方法，其特征在于，其包括，血样经外周血单个核细胞(PBMC)提取和体外酶促反应后，采用高效液相色谱HPLC分离及紫光检测器检测，计算IMPDH酶活性：包括以下步骤：

1)样品预处理

PBMC提取：取肝素抗凝外周血，使用淋巴细胞分离液进行细胞提取，PBS缓冲液清洗后得到PBMC细胞沉淀，-80℃冻存。

体外酶促反应：取冻存PBMC细胞于室温融解，加入孵育液进行体外酶促反应，终止反应后离心取上清液进样；

2)样品分离与测定

采用极性的C18柱(CNW Athena C18-W)，通用型的紫外检测器以及高压泵，含离子对试剂酸性流动相等度洗脱(pH＝5.0～6.0)，分别检测AMP和XMP的峰面积，用标准曲线方程计算出浓度并扣去空白，再根据公式计算得到IMPDH的酶活性值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

通过下述公式计算IMPDH酶活性：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用细胞内含物AMP的浓度对提取的PBMC数量进行标准化，同时通过平行操作扣除空白的方法消除外源AMP产生的干扰。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的酶促反应条件中，IMP和NAD浓度为0.5～1.0mmol/L，孵育时间90～150min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，

色谱条件是，色谱柱采用CNW Athena C18-WP柱(150×4.6mm，3μm)；

流动相采用甲醇-(5～10mmol·L^-1 KH₂PO4+0.3～0.8mmol·L^-1 TBAS)(15∶85，V/V)等度洗脱；

流速1.0ml/min；柱温35℃；紫外检测波长256nm。