[发明专利]一种同时检测多种肝癌常见突变的ctDNA文库构建和测序数据分析方法

权利要求书

1.一种测序文库构建方法，依次包括如下步骤：

（1）将DNA样本依次进行末端修复和3’端加A处理；

（2）将步骤（1）处理后的DNA样本与接头混合物连接，经过PCR扩增后得到文库；

所述接头混合物由n个接头组成；

每个接头均由一条上游引物甲和一条下游引物甲形成部分双链结构得到；上游引物甲中具有测序接头甲、随机标签、锚定序列甲和位于3’末端的碱基T；下游引物甲中具有锚定序列乙和测序接头乙；所述部分双链结构由上游引物中的锚定序列甲和下游引物中的锚定序列乙反向互补形成；

所述测序接头甲和测序接头乙为为根据不同测序平台选择对应的测序接头；

所述随机标签为8-14bp的随机碱基；

所述锚定序列甲长度为14-20bp，连续重复碱基≤3个；

n个接头采用n个不同的锚定序列甲，并且相同位置的碱基平衡，错配碱基数3；

n为12，所述12个接头如下：

接头1由序列表的序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头2由序列表的序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头3由序列表的序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头4由序列表的序列7所示的单链DNA分子和序列8所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头5由序列表的序列9所示的单链DNA分子和序列10所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头6由序列表的序列11所示的单链DNA分子和序列12所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头7由序列表的序列13所示的单链DNA分子和序列14所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头8由序列表的序列15所示的单链DNA分子和序列16所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头9由序列表的序列17所示的单链DNA分子和序列18所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头10由序列表的序列19所示的单链DNA分子和序列20所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头11由序列表的序列21所示的单链DNA分子和序列22所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到；接头12由序列表的序列23所示的单链DNA分子和序列24所示的单链DNA分子形成部分双链结构得到。

2.权利要求1所述的方法构建得到的DNA文库。

3.一种用于构建测序文库的试剂盒，包括权利要求1中所述的接头混合物。

4.一种用于检测DNA样本中肝癌突变的试剂盒，包括权利要求1中所述的接头混合物和引物组合；所述引物组合由引物组І、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ组成；

所述引物组І由序列表的序列28至序列105所示的单链DNA组成；

所述引物组Ⅱ由序列表的序列106至序列187所示的单链DNA组成；

所述引物组Ⅲ由序列表的序列191至序列265所示的单链DNA组成；

所述引物组Ⅳ由序列表的序列266至序列344所示的单链DNA组成。

5.引物组合，由上游引物1355、上游引物3355、index引物、引物组І、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ组成；

所述上游引物1355的核苷酸序列如序列表中序列27所示；

所述上游引物3355的核苷酸序列如序列表中序列188所示；

所述index引物由区段A、index序列和区段B组成；所述区段A如序列表中序列189所示，所述index序列为6-8bp随机碱基，所述区段B如序列表中序列190所示；

所述引物组І由序列表的序列28至序列105所示的单链DNA组成；

所述引物组Ⅱ由序列表的序列106至序列187所示的单链DNA组成；

所述引物组Ⅲ由序列表的序列191至序列265所示的单链DNA组成；

所述引物组Ⅳ由序列表的序列266至序列344所示的单链DNA组成。

6.权利要求5所述的引物组合在制备用于检测DNA样本中肝癌突变的试剂盒中的应用。