[发明专利]一种使用CRISPR/Cas9治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变的方法

说明书

本发明提供了一种使用CRISPR/Cas9治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变的方法。本发明采用经阴道体内质粒转染的方式，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏靶基因E7，降低病毒载量，恢复肿瘤抑制因子RB的功能，从而逆转宿主细胞的恶性表型，大大降低治疗成本以及患者的心理负担。CRISPR/Cas9基因编辑技术在K14‑HPV16宫颈上皮内瘤变的小鼠动物模型中发挥的作用使其成为治疗宫颈上皮内瘤变的非常有前景的治疗方式。该gRNA能够有效的治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变，比现有技术的gRNA具有显著的优势，适宜于临床和病患者中使用。

技术领域

本发明属于基因治疗领域，本发明公开了包括针对高危型人乳头瘤病毒E6E7癌基因序列构建靶向CRISPR/Cas9质粒的方法，并用CRISPR/Cas9靶向敲除高危型人乳头瘤病毒E7癌基因的方法。

背景技术

宫颈癌是世界范围内女性发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤(E.P.Armstrong等，Managed Care Pharmacy杂志，2010，16：217-230)。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPVs)，尤其是HPV16和HPV18，被认为是宫颈癌发病的主要因素。癌蛋白E6和E7在HPV感染的早期表达，其中E6蛋白结合并讲解肿瘤抑制因子p53和促凋亡蛋白BAK从而增加宿主细胞对细胞凋亡的抵抗力并允许病毒DNA复制，E7蛋白则抑制肿瘤抑制性视网膜母细胞瘤1(RB1)释放E2F1转录因子，刺激细胞周期依赖性激酶2(CDK2)/细胞周期蛋白A以及CDK2细胞周期蛋白E复合物的形成，从而消除细胞周期停滞和刺激细胞增殖(Werness BA等，Science杂志，1990，248：76-79)。E6和E7在宫颈癌驱动癌变中的关键作用，使其成为治疗干预的目标。

既往研究表明，使用siRNA靶向HPV E6/E7mRNA可以有效地敲低其表达并诱导HPV阳性细胞系凋亡。然而，siRNA仅在时间上阻断HPV E6/E7mRNA，不会对细胞核中的HPV DNA发挥作用(Shillitoe,E.J，2006，Cancer gene therapy.13：445-450)。

CRISPR/Cas系统是新开发的可编程RNA引导内切核酸酶系统。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single-guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割(Mali P等,Nature Methods,2013,10(10):957-963)。它已经成为包括原核生物，秀丽隐杆线虫和斑马鱼在内的许多生物体的强大基因组编辑工具。该系统由一个位点特异性单引导RNA(sgRNA)和一个Cas9酶组成，可以基本上以5’-N20NGG-3’的形式靶向任何基因组位点(P.Mali等,Science,2013,339：823–826)。在与sgRNA序列互补的基因组位点识别后，Cas9酶诱导双链断裂(DSBs)。DSB主要通过非同源末端连接(NHEJ)修复途径修复，导致靶基因的破坏(E.Heidenreich等,The EMBOJournal,2003,22:2274–2283)。

我们设计了成簇规律间隔的短回文序列相关联的Cas9系统(CRISPR/Cas9)，以直接切割癌基因E7的DNA序列，而不是针对RNA。由CRISPR/Cas9切割产生的双链DNA断裂通过NHEJ途径修复，导致靶基因E7的破坏和消除，可以有效降低病毒的DNA载量，恢复肿瘤抑制因子RB1的功能，并逆转宿主细胞在体外和体内的恶性表型。本发明为HPV持续感染及相关疾病药物的研发提供了新的见解。

发明内容