[发明专利]一种检测蛋白质硫巯基化的荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种检测蛋白质硫巯基化的荧光探针及其制备方法和应用；该探针以七甲川花菁类荧光染料为母体，其化学结构通式如式(I)所示。首次合成的针对线粒体中的蛋白质硫巯基化进行检测的荧光探针，本发明的荧光探针稳定性好，合成简单，使用方便；只与硫巯基化的蛋白质反应，不受其他含巯基/硫的化合物或生物大分子的干扰；探针具有亚细胞靶向性，可特异性的检测线粒体中的硫巯基化蛋白质。该探针在生命科学和医学研究中具有广阔的应用前景；

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种检测蛋白质硫巯基化的荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质硫巯基化修饰(S-sulfhydration)是一中依赖于硫化氢(H₂S)和过硫化合物(H₂S_n)的可逆性蛋白翻译后修饰。H₂S和H₂S_n可对蛋白质中特定的半胱氨酸巯基进行修饰，发生硫巯基化，改变蛋白质构相，调节蛋白质功能，是与磷酸化和乙酰化相似的新的信号转导调控方式。蛋白质硫巯基化修饰在众多生理病理过程中发挥了关键的作用，包括自噬、氧化应激、神经传导、凋亡、炎症等。此外，已有研究表明蛋白质硫巯基化修饰的过度激活或抑制与心血管疾病、呼吸系统疾病以及神经退行性疾病密切相关。蛋白质硫巯基化修饰作为一个研究热点，越来越受到研究人员的关注，发展灵敏度高、选择性好，能“实时”动态跟踪蛋白质硫巯基化修饰的分析与检测技术是最具挑战性的前沿课题之一，也是阐明蛋白质硫巯基化修饰如何发挥生理病理作用的前提。

目前检测蛋白硫巯基化的方法主要有生物素开关法(biotin switch assay)、半胱氨酸标记法(cysteinyl labelling assay)马来酰亚胺法(maleimide assay)。这些方法均存在一定不足，包括假阳性率高、操作步骤繁琐、灵敏度有限、无法实现在体实时监测等缺点。通过大量筛选，小分子荧光探针技术能够实现与硫巯基化蛋白发生特异性的反应，灵敏度较高，有较好的生物相容性及稳定性。近年来，小分子荧光探针技术逐渐成为医学和生命科学领域不可或缺的研究手段之一。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足提供一种检测蛋白质硫巯基化的荧光探针及其制备方法与应用；本发明提供的荧光探针本身只有微弱的荧光，但可与硫巯基化蛋白发生迅速的反应，生成强荧光产物，实现大幅的荧光增强，从而实现测定表现蛋白质硫巯基化修饰的水平和定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供一种荧光探针，具有式I所示结构式：

其中，R1基团为氟、氯、溴、碘、C₁-C₄烷基或三氟甲基，R₂基团为氧或硫。

第二方面，本发明提供式I所示荧光探针的制备方法，所述方法包括如下步骤：

以二氯甲烷为溶剂，在-10～25℃条件下混合IR780衍生物和取代的肉桂酰氯升温至25～28℃进行反应，即得所述荧光探针。

具体而言：将IR780衍生物溶于5mL二氯甲烷中，于0℃下加入R₁、R₂取代的肉桂酰氯溶于10ml二氯甲烷，室温反应两个小时。反应液旋干，用中性三氧化二铝过柱，得到式I化合物，反应式如下：

优选的，所述IR780衍生物和取代的肉桂酰氯的摩尔比为1:0.6～1:1.8。

优选的，所述IR780衍生物是通过如下步骤制备而得：

以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，IR780与乙酸钠在35～90℃反应3～10小时，即得所述IR780衍生物。

优选的，所述IR780与乙酸钠的摩尔比为1:0.1～1:2。